Ферменты

Это возможно лишь потому, что в клеточном содержимом ферменты распределены не хаотически, а строго упорядоченно. С современной точки зрения клетка представляется высокоорганизованной системой, в отдельных частях которой осуществляются строго определенные биохимические процессы. В соответствии с приуроченностью их к определенным субклеточным частицам или отсекам (компартментам) клетки в них локализованы те или иные индивидуальные ферменты, мультиэнзимные комплексы, полифункциональные ферменты или сложнейшие метаболоны.

Разнообразные гидролазы и лиазы сосредоточены преимущественно в лизосомах. Внутри этих сравнительно небольших (несколько нанометров в диаметре) пузырьков, ограниченных мембраной от гиалоплазмы клетки, протекают процессы деструкции различных органических соединений до тех простейших структурных единиц, из которых они построены. Сложные ансамбли окислительно-восстановительных ферментов, такие, например, как цитохромная система, находятся в митохондриях. В этих же субклеточных частицах локализован набор ферментов цикла дикарбоновых и трикарбоновых кислот. Ферменты активирования аминокислот распределены в гиалоплазме, но они же есть и в ядре. В гиалоплазме присутствуют многочисленные метаболоны гликолиза, структурно объединенные с таковыми пентозофосфатного цикла, что обеспечивает взаимопереключение дихотомического и апотомического путей распада углеводов. В то же время ферменты, ускоряющие перенос аминокислотных остатков на растущий конец полипептидной цепи и катализирующие некоторые другие реакции в процессе биосинтеза белка, сосредоточены в рибосомальном аппарате клетки. Нуклеотидилтрансферазы, ускоряющие реакцию переноса нуклеотидных остатков при новообразовании нуклеиновых кислот, локализованы в основном в ядерном аппарате клетки. Таким образом, системы ферментов, сосредоточенные в тех или иных структурах, участвуют в осуществлении отдельных циклов реакций. Будучи тонко координированы друг с другом, эти отдельные циклы реакций обеспечивают жизнедеятельность клеток, органов, тканей и организма в целом.

7. Методы  выделения и очистки ферментов

Долгое  время вполне обоснованно считали, что все ферменты - тела белковой природы. Однако в начале 80-х годов была неожиданно открыта способность низкомолекулярных рибонуклеиновых кислот ускорять реакцию превращения предшественников РНК в функционально значимый продукт, т. е. возникло представление о полирибонуклеотидной природе некоторых ферментов, названных рибозимами.

Хотя  уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов - рибонуклеазы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома с, трудно ожидать, что синтетическое получение ферментов получит широкое распространение в ближайшие десятилетия ввиду его сложности и дороговизны, поэтому единственный реальный в настоящее время способ получения ферментов - это выделение их из биологических объектов.

Выделяют  ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше -10°С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу относится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Этот метод был введен в химию ферментов А. Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию ферментологии. Сейчас адсорбционный метод выделения и очистки ферментов разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Одна из модификаций адсорбционного метода - афинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, исследуемый фермент элюирует с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноэтажную (аффинная сорбция - элюция) схему выделения.

Для успешного  выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала, вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые несут в своем составе многие индивидуальные ферменты. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с потерей ферментативной активности. Этому способствует проведение операций в присутствии защитных добавок, в частности HS-содержащих соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.):

HS ¾ CH₂ ¾ СН₂ ¾ NН  HS¾CH₂¾CH(ОН) ¾ СН (ОН) ¾ СH₂ ¾ SH

Цистеамин    Дитиотреитол

Очень важно  поддерживать на всех этапах выделения  ферментов низкую температуру, так как некоторые из них даже при -80°С теряют активность.

Для оценки гомогенности ферментного препарата  прибегают к обычным методам белковой химии. Переломным моментом в усовершенствовании методов получения высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов было открытие способности их кристаллизоваться, осуществленное впервые в 1906 г. А. Д. Розенфельдом (им была получена в виде кристаллов оксидаза из корней редьки) и приобретшее с 1926 г. широкую известность после работы Д. Самнера по получению кристаллической уреазы из бобов канавалии. Нередко о степени чистоты ферментного препарата судят по его биологической активности; если активность при дальнейшей очистке не возрастает, препарат можно считать гомогенным. Из 2003 включенных в список ферментов более 1500 выделено и в той или иной мере очищено, третья часть их закристаллизована, у нескольких сотен выяснена первичная, а у нескольких десятков - третичная структура.

Литература

1. Власова  З.А. Биология. Справочник школьника.  М., Всероссийское слово, 1995 г.

2. Хомченко  Г.Л. Химия для поступающих  в ВУЗы. Учебное пособие. М., Высшая  школа, 1993 г.

3. Биологический  энциклопедический словарь. Под  ред. Гилярова М.С. М., Советская  энциклопедия, 1987 г.