Ферменты, используемые в генной инженерии их основные свойства и применение

- транспортная РНК (тРНК), переносящая аминокислоты к растущей на рибосоме белковой цепочке во время процесса трансляции;

- рибосомная РНК (рРНК), входящая в состав рибосомы;

- микроРНК, регулирующая активность генов;

- каталитическая РНК, обладающая свойствами ферментов.

РНК-полимераза осуществляет синтез с нуля. Это возможно вследствие того, что взаимодействие начального нуклеотида гена и РНК-полимеразы позволяет  ей закрепиться на цепочке и обрабатывать следующие нуклеотиды. Это отчасти  объясняет, почему РНК-полимераза обычно начинает транксрипцию с АТФ, за которым следует ГТФ, УТФ и затем ЦТФ. В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза обладает также геликазнымдействием.

Таким образом, биосинтез  РНК осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. В ядрах эукариотов обнаружены 3 специализированные РНК-полимеразы: РНК-полимераза I, синтезирующая пре-рРНК; РНК-полимераза II, ответственная за синтез пре-мРНК; РНК-полимераза III, синтезирующая пре-тРНК. РНК-полимеразы - олигомерные ферменты, состоящие из нескольких субъединиц - 2α, β, β', σ. Субъединица о (сигма) выполняет регуляторную функцию, это один из факторов инициации транскрипции, РНК-полимеразы I, II, III, узнающие разные промоторы, содержат разные по строению субъединицы σ.

2 Ферменты, модифицирующие ДНК

В клетке ДНК находится  в компактном, т. н. суперскрученном состоянии, иначе она не смогла бы в ней уместиться. Для протекания жизненно важных процессов ДНК должна быть раскручена, что производится двумя группами белков — топоизомеразами и хеликазами.

Топоизомеразы — ферменты, которые имеют и нуклеазную и лигазную активности. Эти белки изменяют степень суперскрученности в ДНК. Некоторые из этих ферментов разрезают спираль ДНК и позволяют вращаться одной из цепей, тем самым уменьшая уровень суперскрученности, после чего фермент заделывает разрыв. Другие ферменты могут разрезать одну из цепей и проводить вторую цепь через разрыв, а потом лигировать разрыв в первой цепи. Топоизомеразы необходимы во многих процессах, связанных с ДНК, таких как репликация и транскрипция.

Хеликазы — белки, которые являются одним из молекулярных моторов. Они используют химическую энергию нуклеотидтрифосфатов, чаще всего АТФ, для разрыва водородных связей между основаниями, раскручивая двойную спираль на отдельные цепочки. Эти ферменты важны для большинства процессов, где белкам необходим доступ к основаниям ДНК.

В различных процессах, происходящих в клетке, например, рекомбинации и репарации, участвуют ферменты, способные разрезать и восстанавливать целостность нитей ДНК. Ферменты, разрезающие ДНК, носят название нуклеаз. Нуклеазы, которые гидролизуют нуклеотиды на концах молекулы ДНК, называются экзонуклеазами, а эндонуклеазы разрезают ДНК внутри цепи. Наиболее часто используемые в молекулярной биологии и генетической инженерии нуклеазы — это рестриктазы, которые разрезают ДНК около специфических последовательностей. Например, фермент EcoRV (рестрикционный фермент № 5 из E. coli) узнаёт шестинуклеотидную последовательность 5'-GAT|ATC-3' и разрезает ДНК в месте, указанном вертикальной линией. В природе эти ферменты защищают бактерии от заражения бактериофагами, разрезая ДНК фага, когда она вводится в бактериальную клетку. В этом случае нуклеазы — часть системы модификации-рестрикции. ДНК-лигазы сшивают сахарофосфатные основания в молекуле ДНК, используя энергию АТФ. Рестрикционные нуклеазы и лигазы используются в клонированиии фингерпринтинге.

Существует, как уже упоминалось  ранее, важная для метаболизма ДНК группа ферментов, которые синтезируют цепи полинуклеотидов изнуклеозидтрифосфатов — ДНК-полимеразы. Они добавляют нуклеотиды к 3'-гидроксильной группе предыдущего нуклеотида в цепи ДНК, поэтому все полимеразы работают в направлении 5'--> 3'. В активном центре этих ферментов субстрат — нуклеозидтрифосфат — спаривается с комплементарным основанием в составе одноцепочечной полинуклеотидной цепочки — матрицы.

3 Лигазы

Лигаза (лат. Ligāre — сшивать, соединять) - фермент, катализирующий соединение двух молекул с образованием новой химической связи (лигирование). При этом обычно происходит отщепление (гидролиз) небольшой химической группы от одной из молекул. Лигазы относятся к классу ферментов EC 6. В молекулярной биологии лигазы подкласса 6.5 классифицируют на РНК-лигазы и ДНК-лигазы.

Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях находит ДНК-лигаза бактериофага Т4 . Реакция лигирования протекает в два этапа. Вначале образуется промежуточный комплекс фермент-АМР (этап 1), после чего остаток АМР переносится на 5'-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2). Образовавшаяся фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки 3'-ОН группы соседнего нуклеотида, что приводит к образованию новой фосфодиэфирной связи, восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова ДНК. Т4- ДНК-лигаза осуществляет соединение фрагментов двухцепочечной ДНК, обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Необходимым условием протекания лигирования является наличие 5'- концевого фосфата и 3'-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по "тупым" концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК- лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5'- фосфорилированных концов одноцепочечных ДНК или РНК с 3'-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых кислот.

4 Фосфотаза

Фосфатаза – фермент, который дефосфорилирует субстрат (как правило другой белок) в результате гидролиза сложноэфирной связи фосфорной кислоты. При этом образуется фосфатный анион и молекула продукта с гидроксильной группой. По своему каталитическому и физиологическому действию фосфатаза является антагонистом фосфорилазы икиназы, которые присоединяют фосфатную группу к субстрату

Процесс дефосфорилирования является таким же важным, как и процесс фосфорилирования,  и соответственно,  протеинфосфатазы являются интегральными компонентами сигнальных систем,  управляемых протеинкиназами. В ряде случаев дефосфорилирование возвращает белки обратно в состояние покоя. Хорошим примером является серин/треониновая фосфатаза РР1G,  которая дефосфорилирует фосфорилазу а, тем самым, завершая распад гликогена. Существует ряд белков (например, гликогенсинтаза, Src, c-Jun, p56, NF-AT), которые фосфорилированы в состоянии покоя, а в активное состояние переходят после процесса дефосфорилирования.  В частности, фактор транскрипции c-Jun  требует как дефосфорилирования серин/треониновых аминокислотных остатков вблизи участка, связывающего ДНК, так и фосфорилирования серинов в N-концевом участке для перехода полностью в активное состояние. В эукариотической клетке около 30%  процентов белков подвергаются фосфорилированию. Обратимое фосфорилирование белков,  катализируемое протеинкеназами и фософопротеинфосфатазами,  регулирует многие внутриклеточноые процессы. Фосфопротеинфосфатазы подразделяются на три семейства – РРР, РРМ, РТР. РРР и РРМ включают фосфосерин- и фосфотреонин-  специфичные ферменты, РРМ – семейство фосфатаз, активируемых магнием.  РТР – фосфотирозин-специфичные фосфатазы и фосфатазы двойной специфичности. РТР могут дефосфорилировать все три фосфосодержащих остатка аминокислот.  Протеинфосфатаза типа РР2А входит вместе с РР1, РР4, РР6, РР2B, РР5 и РР7 в семейство РРР. Существует классификация, которая делит фосфатазы на 4 группы: РР1, РР2А, РР2В и РР2С по относительной неспецифичности. Растворимая протеинфосфатаза, специфичная для фосфотирозинов (РТР1В),  впервые была выделена из человеческой плаценты в 1988  г. Определение ее аминокислотной последовательности и выделение участка ДНК,  кодирующего каталитический домен, позволило выявить родственные гены и их продукты - новые неизвестные фосфатазы.

Данные по клонированию показывают,  что эти протеинтирозинфосфатазы относятся к семейству мультидоменных белков, имеющих сильные различия в структуре, что обеспечивает их многообразие. Их можно подразделить на две группы: трансмембранные или рецептороподобные РТРазы и цитозольные РТРазы. Ни те, ни другие не связаны с серин/треонин-специфичными фосфатазами. Это отличает протеинфосфатазы от семейства протеинкиназ,  в котором серин/треониновые и тирозиновые киназы имеют общую родословную. В отличие от серин/треониновых фосфатаз,  являющихся-+олигомерами,  субъединичный состав которых определяет субстратную специфичность фермента,  тирозиновые фосфатазы все относятся к мономерным ферментам.

Некоторые функциональные различия между протеинфосфатазами были выявлены после открытия их ингибиторов. Например, окадаиковая кислота (опухолевый промотор) является ингибитором РР1 и РР2А, тогда как циклоспорин (используется для инактивации Т-лимфоцитов и предотвращения отторжения трансплантированного органа) является селективным ингибитором РР2В (кальцинейрина). Группа РР2А включает разнообразные ферменты из клеток млекопитающих, которые в основном находятся в цитозоле,  хотя описаны и формы,  связанные с ядрами, плазматической мембраной, микротрубочками и микрофиламентами. Поскольку как рибосомальные белки,  так и факторы трансляции подвергаются обратимому фосфорилированию,  предполагается,  что оно играет важную роль в регуляции трансляции.

Однако, участие фосфатаз в системах передачи сигналов,  механизмы регуляции их активности в настоящее время недостаточно изучены.  Предполагается,  что в геноме млекопитающих закодировано 100-120 каталитических субъединиц фосфатаз, кроме того, существует большое количество регуляторных субъединиц,  все это свидетельствует о большом количестве мишеней и регулируемых функций.

5 Киназы

Киназы — ферменты, относящиеся к классу трансфераз, подклассу фосфотрансфераз и катализирующие реакции переноса фосфорильного остатка (—РО₃Н₂) от АТФ (реже — от других нуклеозидтрифосфатов) на различные субстраты. Катализируемые К. реакции фосфорилирования играют важную роль в регуляции обмена веществ, в первую очередь в сохранении, переносе и использовании энергии макроэргических связей АТФ и других нуклеозидтрифосфатов (см. Макроэргические соединения,Обмен веществ и энергии). Активность некоторых К. в биологических жидкостях человека имеет диагностическое значение при ряде патологических состояний.

При участии К. происходит фосфорилирование низкомолекулярных (глюкозы, витаминов, креатина и др.) и высокомолекулярных (белков, в т.ч. ферментных белков) соединений. Фосфорильная группа в киназных реакциях может быть перенесена на гидроксильную группу (фосфотрансферазы со спиртовой группой в качестве акцептора), карбоксильную группу (фосфотрансферазы с карбоксильной группой в качестве акцептора), азотистую группу (фосфотрансферазы с азотистой группой в качестве акцептора) или фосфатную группу (фосфотрансферазы с фосфатной группой в качестве акцептора). Катализируемые К. реакции, связанные с превращением богатой энергией фосфатной связи АТФ в бедную энергией связь, практически необратимы. Однако реакции, катализируемые аденилаткиназой, ацетаткиназой, нуклеозидмонофосфаткиназой, нуклеозиддифосфаткиназой и некоторыми другими К., одинаково легко протекают справа налево и слева направо. Как правило, для проявления полной активности К. необходимы ионы двухвалентных металлов, образующих металлонуклеотидный комплекс, который и является истинным субстратом киназ. В организме человека такими ионами являются ионы Mg²⁺.

Киназы представляют собой белки с молекулярной массой от 21000 до 1300000. Функционально-активные молекулы многих К. имеют субъединичное строение, ряд К. существует в тканях во множественных формах (см. Ферменты). Субстратная специфичность К. варьирует от узкой (у креатинкиназы) до широкой (у нуклеозиддифосфаткиназы).

Важную роль в углеводном обмене человека и животных играет гексокиназа, которая катализирует первую реакцию гликолиза, лимитирующую его скорость, — реакцию фосфорилирования гексозы, в первую очередь глюкозы, с образованием гексозо-6-фосфата. Интенсивный синтез гексокиназы, повышение ее активности и изменение изоферментного состава происходят в опухолевой ткани. В сыворотке крови здоровых людей гексокиназа отсутствует, но появляется в сыворотке крови при опухолевых заболеваниях, поэтому определение активности гексокиназы в сыворотке крови является дополнительным тестом при диагностике злокачественных опухолей и оценке эффективности их лечения.

Другим ключевым ферментом  углеводного обмена является фосфофруктокиназа, принимающая участие в регуляции скоростей гликолиза и гликогенолиза, и пируваткиназа, катализирующая образование АТФ в процессе гликолиза при превращении фосфоенолпировиноградной кислоты (фосфоенолпирувата) в пировиноградную (пируват).

Аденилаткиназа (аденилаткиназу, выделенную из мышц, называют миокиназой) катализирует обратимую реакцию взаимопревращения адениловых нуклеотидов (АТФ + АМФ = 2АДФ) и тем самым обеспечивает сохранение и использование энергии аденилатной системы и включение АМФ в качестве активного компонента в систему обмена энергии. Участвуя в поддержании равновесия между адениловыми нуклеотидами, аденилаткиназа осуществляет метаболический контроль в клетке, поскольку соотношение концентраций адениловых нуклеотидов является фактором, регулирующим баланс между биохимическими системами, образующими и использующими АТФ. Активность аденилаткиназы в сыворотке крови резко возрастает в первые дни после развития инфаркта миокарда, при ряде других патологических состояний. В мышцах и цереброспинальной жидкости активность аденилаткиназы значительно снижается при мышечной дистрофии Дюшенна.

Креатинкиназа (креатинфосфокиназа) катализирует реакцию обратимого переноса фосфорильной группы с АТФ на креатин с образованием макроэргического соединения креатин-фосфата (см. Креатинин),участвует в регуляции динамического соотношения концентраций АТФ: АДФ в клетках. В мышечной ткани креатинкиназа составляет 10—20% от всех растворимых саркоплазматических белков. Активность креатинкиназы в сыворотке крови возрастает при миопатиях, прогрессирующих мышечных дистрофиях, гипотиреозе, после инфекционных болезней; как правило, при этом изменяется и изоферментный спектр фермента. Определение активности креатинкиназы служит ценным диагностическим тестом при инфаркте миокарда. В первые часы и дни заболевания активность фермента в крови резко возрастает за счет выхода в кровоток так называемой МВ-формы, содержащейся в сердечной мышце. На основании последовательных измерений активности креатинкиназы в сыворотке крови можно судить о степени некротического процесса в миокарде и оценить эффективность проводимой терапии.

Особую группу К. составляют протеинкиназы, катализирующие перенос фосфорильного концевого остатка АТФ на остаток серина или треонина в молекуле белкового субстрата. Протеинкиназы, зависимые от циклического 3',5'-АМФ, кальция, кальмодулина и фосфолипидов, участвуют в передаче сигналов внутри клеток, регулируют активность многих ферментов за счет фосфорилирования их молекул и изменения их каталитической активности. Разнообразные протеинкиназы являются ключевыми регуляторными ферментами на важнейших путях обмена веществ в организме, в т.ч. регуляторными ферментами мембранных процессов в различных тканях.

С генетически обусловленной  недостаточностью или отсутствием  К. связан ряд наследственных болезней человека. Так, врожденная недостаточность  гексокиназы, фосфоглицераткиназы или аденилаткиназы в эритроцитах может быть причиной гемолитической анемии. Одна из наиболее распространенных наследственных ферментопатий — недостаточность пируваткиназы в эритроцитах у гомозигот — выражается хронической гемолитической анемией. При наследственно обусловленной недостаточности галактокиназы в крови в раннем детском возрасте развиваются галактозурия («галактозный диабет») и катаракта. Дефект фосфофруктокиназы мышц приводит к миопатии. Наследственная недостаточность киназы фосфорилазы b в печени вызывает нарушение депонирования гликогена в печени, гепатомегалию и задержку роста у детей. Генетически обусловленная недостаточность карбамоилфосфатксинтазы (ключевого фермента синтеза мочевины), относящейся к фосфотрансферазам с карбоксильной группой в качестве акцептора, может привести к смерти новорожденных вследствие развития гипераммониемии при кормлении их белковой пищей.

Метод определения активности К. зависит от конкретной исследуемой  реакции и часто состоит в  оценке содержания фосфорилированного или дефосфорилированного продукта в пробе. Общим для многих К. методом определения активности является регистрация количества АДФ или АТФ.

Унифицированным методом  определения активности креатинкиназы служит метод с использованием в качестве субстрата реакции креатина. Активность фермента пропорциональна количеству неорганического фосфора, образующегося в результате кислотного гидролиза продукта креатинкиназной реакции — креатинфосфата. Неорганический фосфор определяется по цветной реакции с молибденом аммония. В норме активность креатинкиназы в крови, установленная с помощью этого метода, достигает 100 нмоль/(с×л), или до 6 ME. Активность МВ-формы креатинкиназы в норме составляет менее 2% от общей активности фермента. Вторым методом определения активности креатинкиназы, также принятым в качестве унифицированного, является метод с использованием в качестве субстрата креатинфосфата. Активность фермента пропорциональна количеству креатина, образующегося в результате ферментативной реакции. Креатин определяется по цветной реакции с a-нафтолом. В норме активность креатинкиназы в сыворотке крови, установленная с помощью этого метода, составляет от 0 до 220 нмоль/(с×л), или от 0 до 13 ME [Международная единица равна 16,67 нмоль/(с×л)].