Ферменты генетической инженерии

Подготовка сред к стерилизации. При автоклавировании 3-5% жидкости теряется в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5% дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию.

Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях. Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками. Они предохраняют среду от заражения микроорганизмами, находящимися в окружающем воздухе. Пробки должны быть достаточно плотными, чтобы выполнить эту функцию, но с равномерным распределением волокон ваты, так как через них происходит газообмен культуры с окружающей средой. Слишком плотные пробки затрудняют снабжение культур воздухом.

Для приготовления пробки плоский кусок ваты, взятый вдоль волокна, скатывают валиком. Чтобы придать пробке прочность, ее прокатывают между ладонью и чистым стеклом, лежащим на столе. Длина пробки для обычной пробирки примерно 4 см. Пробка должна входить в пробирку на 1,5—2,0 см (рис. 34). Для сохранения формы пробку вынимают из горлышка, слегка вращая. Удобно обернуть пробку чистой марлевой салфеткой.

Перед стерилизацией пробки можно прикрыть бумажными колпачками. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерилизоваться в автоклаве, целлофаном, фольгой или другими материалами, не пропускающими пар, так как пар должен обязательно проникать через пробку в сосуд, иначе среды не нагреются до нужной температуры и не простерилизуются. При использовании стеклянных, резиновых, корковых и других пробок их завертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой. Пробки в сосуде меняют стерильно около пламени горелки.

Выбор режима автоклавирования. В микробиологической практике стерилизацию в автоклавах осуществляют при температуре в пределах 111—138°, т. е. 0,5 до 2,5 атм. Температура ниже 111° не может считаться надежной; температура выше 138°, как правило, не является необходимой, к тому же, чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. При использовании автоклавов без вакуумных насосов наиболее надежными считаются следующие режимы стерилизации: 15—45 мин при 121° (1 атм) и 10—30 мин при 128° (1,5 атм). Микробиологи чаще всего стерилизуют среды при 0,5 и 1 атм.

Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяются прежде всего их составом, термоустойчивостью или термолабильностью компонентов. Такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (пивное сусло, соки, дрожжевой автолизат и др.) обычно стерилизуют при 0,5 атм в течение 15—30 мин. Мясопептонные среды можно стерилизовать при 1,0 атм 20 мин. Среды, содержащие агар, стерилизуются труднее, потому что стерилизация начинается фактически после того, как агар расплавится. Но и расплавленный агар требует для стерилизации вдвое больше времени, чем тот же объем воды. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (например, тальк) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поскольку они плохо передают тепло и очень медленно прогреваются. Их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 ° в течение 2 ч или 1 ч при 170 °. В этом случае слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см.

Имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающиеся особой термостабильностью. К ним относится почва, причем она, кроме того, и нагревается с замедленной скоростью. Ее обычно стерилизуют при 1 атм, либо один раз 2 ч, либо два дня подряд по 1 ч, а иногда — при 2 атм 2 ч.

Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать рН среды. При кислой реакции многие вещества, входящие в ее состав, могут подвергнуться гидролизу. Чем ниже значение рН, чем выше температура и продолжительнее время стерилизации, тем интенсивнее происходит гидролиз. В результате после стерилизации перестают застывать среды с желатиной и даже с агаром. Если реакция среды щелочная, то при стерилизации выпадают в осадок соли железа, карамелизуются и становятся непригодными для использования бактериями сахара. В некоторых случаях в процессе стерилизации изменяется рН среды. Так, если рН среды с углеводами выше 7,0, то может произойти ее подкисление до рН 6,0. Особенно часто это наблюдается в присутствии ксилозы. Чтобы избежать таких явлений, рекомендуется углеводы, фосфаты, соли железа автоклавировать отдельно в виде более или менее концентрированных растворов в дистиллированной воде при том значении рН, которое обеспечивает целостность вещества. После стерилизации растворы стерильно объединяют в нужном соотношении. Таким приемом раздельной стерилизации в микробиологии пользуются довольно часто, поскольку многие компоненты сред нельзя стерилизовать одним и тем же способом.

Режим автоклавирования в значительной степени зависит от объема стерилизуемого субстрата. Чем больше объем, тем больше времени при одной и той же температуре (давлении) требуется для обеспечения надежности стерилизации. Имеет значение толщина стенок и форма емкостей. Это нужно учитывать в практической работе. Например, не следует стерилизовать термочувствительный субстрат одновременно в пробирках и   больших бутылях. Если среда стерилизуется по режимам,  рекомендованным для   малых   объемов, содержимое  бутыли может не простерилизоваться. Если же стерилизация проводится с расчетом на большой объем, среда в пробирке прогревается значительно дольше, чем требуется, и может испортиться.

После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают 2—3 суток в термостате при 30°. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново.

Дробная стерилизация (тиндализация) и пастеризация

Тиндализация, или дробная стерилизация, была предложена в 1877 г. Тиндалем. Она применяется для сред, портящихся под действием температур выше 100°.   Тиндализацию осуществляют текучим паром в автоклаве с незавинченной крышкой или в кипятильнике Коха. Среды прогревают несколько раз по 10—15 мин. Между прогреваниями среды ставят в термостат при температуре 30° на 8—12 ч для прорастания жизнеспособных спор. Среды, не выдерживающие нагревания при 100°, прогревают более осторожно при 60—80° через каждые 8— 12 ч 4—5 дней подряд.

Однократный прогрев материала при температуре ниже 100° известен под названием пастеризация. Этот метод, предложенный Пастером, предназначен для уничтожения только бесспоровых форм микроорганизмов. Следовательно, в подавляющем большинстве случаев он не обеспечивает стерильности. Пастеризацию проводят при 60—80 ° 10—30 мин. Пастеризацию используют в пищевой промышленности для обработки молока, фруктовых соков, вина, пива и др.

Стерилизация фильтрованием

Фильтрованием стерилизуют синтетические   среды строго определенного состава, которые содержат легкоразрушающиеся или летучие компоненты — витамины, аминокислоты (цистеин и цистин), белки, ароматические углеводороды, антибиотики и др. Фильтрование жидкостей осуществляют через мелкопористые материалы, легко адсорбирующие клетки микроорганизмов: асбест, целлюлозу, фарфор, каолин и т. д.

Стерилизующими фильтрами теоретически считают такие, размер пор которых не превышает 0,7 мкм. В практике же пригодность фильтров для стерилизации устанавливают путем пробной фильтрации через них суспензии какого-либо мелкого микроорганизма, например Serratia marcescens. Для проверки на стерильность фильтрат в большом количестве высевают на питательную среду. Если в течение 5 суток тест-организм не вырастет, фильтры могут быть использованы для стерилизации.

Наиболее широкое распространение в микробиологической практике получили мембранные фильтры. Это диски разного размера, диаметра, напоминающие бумажные. Их готовят на основе нитроцеллюлозы. Мембранные фильтры в зависимости от величины пор применяются для фильтрования и стерилизации. Для стерилизации используют отечественные фильтры № 1—4, фильтры № 5—10 фирмы «СИНПОР» и марок VF, VM, VC, SLGS, SLHA, DA фирмы «МИЛЛИПОР».

Плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой, называются фильтрами Зейтца. В зависимости от диаметра пор они обозначаются разными индексами: ЕК — поры диаметром 1,5 — 1,8; EKS — 1,2 — 1,5; EKS-1 — 1,0 — 1,2; ЕКП — 0,8 — 1,0 мкм. В России выпускают асбестовые фильтры марок Ф2 и СФ. Стерилизующими являются СФ-3 и СФ-4.

Асбестовую пластинку помещают в специальный держатель, который обычно изготавливают из нержавеющей стали, и крепко зажимают винтамл между верхней (цилиндрической) и нижней (воронкообразной) частями держателя. Трубка нижней части держателя через резиновую пробку проходит в колбу Бунзена. Нередко весь этот прибор в собранном виде называют фильтром Зейтца.

Для стерилизации используют также стеклянные пористые фильтры, изготовленные из каолина с приместью кварцевого песка — «свечи» Шамберлана и из инфузорной земли — «свечи» Беркефельда. Пористость первых обоз начается буквой L с цифрами от   1    до   13   соответственно уменьшению   диаметра     пор фильтра от 9 до 1,2 мкм. Мелкопористые свечи обозначаются также маркой «В», крупнопористые — «F». Фильтры Беркефельда обозначают буквами V, N, W, что соответствует следующим размерам пор (мкм): 8—12, 5—7, 3—4.

«Свечи» и специальные держатели с закрепленными в них асбестовыми фильтрами герметически соединяют с колбой Бунзена для фильтрации в вакууме (рис. 35). Перед употреблением фильтры, их держатели и приемник фильтрата должны быть простерилизованы.

Мембранные фильтры стерилизуют автоклавированием при 1 ати 15 мин или длительным кипячением. Держатель вместе с резиновой пробкой заворачивают в бумагу и автоклавируют при 1 ати 20—30 мин. Фильтры Зейтца автоклавируют в собранном виде. «Свечи» стерилизуют вместе с резиновыми пробками в автоклаве. Колбу Бунзена закрывают ватной пробкой, в отводную трубку вставляют ватный тампон и стерилизуют горячим воздухом.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ СТЕКЛЯННОЙ ПОСУДЫ

Основным способом стерилизации стеклянной посуды является обработка ее сухим горячим воздухом при температуре не выше 180° в течение 1—3 ч. При этом погибают и вегетативные клетки, и споры   микроорганизмов. Стерилизацию осуществляют в специальных   суховоздушных     (сухожаровых)  стерилизаторах и сушильных шкафах, приспособленных   для   стерилизации. Они различаются по  форме и способам обогрева, но имеют сходное устройство. Их делают из термостойких материалов — обычно из металла и асбеста. Внутри стерилизатора имеются полки для размещения посуды, а   наверху отверстие, в котором с   помощью   пробки 
укрепляют термометр. У стенки стерилизатора (шкафа) или   вблизи   греющей 
поверхности температура   всегда значительно выше, чем внутри, поэтому  ртутный   шарик  термометра должен находиться внутри шкафа на расстоянии 6—8 см от верх 
ней стенки. В верхней части сушильных шкафов   имеется также отверстие для вентиляции, которое при стерилизации закрывают. Стерилизаторы и шкафы с электрическим обогревом   снабжены терморегулятором, обеспечивающим автоматическое поддержание 
необходимой температуры.

Подготовка посуды к стерилизации. Посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и завернута в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. Посуду развертывав

ют непосредственно перед употреблением. В верхние концы пипеток вставляют ватные тампоны. Торчащие из пипеток волокна ваты сжигают в пламени горелки. Пипетки заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4—5 см. Обмотку начинают с оттянутого конца и постепенным движением бумаги по спирали заканчивают у конца с ватным тампоном. Завернутые пипетки для предохранения бумаги от загрязнения и разрывов перед стерилизацией упаковывают по нескольку штук вместе или помещают в специальные металлические или картонные пеналы. Чашки Петри обычно заворачивают в пакеты по 2—4 штуки, шпатели — обязательно по отдельности, но затем, как и пипетки, их объединяют в общий сверток. Колбы, пробирки и трубки Бурри закрывают ватными пробками. На пробки можно надеть бумажные колпачки, предохраняющие горлышко от пыли.

Стерилизация. Посуду, подготовленную для стерилизации, загружают в стерилизатор (или в сушильный шкаф) не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и равномерный, надежный прогрев стерилизуемого материала. Стерилизатор (сушильный шкаф) во время работы должен быть плотно закрыт. При отсутствии терморегулятора, необходимо строго следить за температурой, так как при понижении ее не осуществится стерилизация, а при нагреве выше 180° бумага и пробки начинают обугливаться. По окончании стерилизации шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не упадет до 80°, так как при резком охлаждении иногда нарушается стерильность материала, а сильно нагретое стекло может растрескаться. Лучше всего .выгружать посуду только после того, как температура в стерилизаторе сравняется с комнатной.

Посуду можно стерилизовать и в автоклаве. Режим стерилизации в этом случае существенно зависит от объема сосудов и толщины стекла. Для автоклавирования посуду готовят, как и для сухожаровой стерилизации. Следует иметь в виду, что в автоклаве посуда увлажняется.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ИНСТРУМЕНТОВ И ПРИБОРОВ

Мелкие металлические инструменты: петли, иглы, пинцеты, ножницы, шпатели стерилизуют прокаливанием в пламени (т. е. нагреванием докрасна) непосредственно перед использованием. На пламени кратковременно обжигают предметные и покровные стекла, стеклянные шпатели и палочки, фарфоровые ступки и пестики, горлышки колб, пробирок, бутылок, а также ватные пробки при пересевах культур и разливе сред. В пламени погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.

Шприцы лучше всего стерилизовать сухим жаром при 160° либо в собранном, либо в разобранном виде.   В первом   случае длительность стерилизации 75 мин, во втором — 60 мин. Собранные шприцы вместе с иглой стерилизуют в пробирке, закрытой ватной пробкой, разобранные заворачивают в бумагу или ткань. Можно стерилизовать шприцы и в автоклаве при 1 ати в течение 15—20 мин. Автоклавируют их только в разобранном виде, иначе они повреждаются. Прокаливать шприцы нельзя, так как от этого они портятся.

Термостойкие приборы для культивирования микроорганизмов, а также детали к этим приборам, резиновые пробки и шланги стерилизуют в автоклаве. При этом емкости закрывают в бумагу. Режим автоклавирования выбирают в соответствии с термостойкостью материала, из которого сделан прибор.

Некоторые предметы (металлические инструменты, мелкие стеклянные детали, мембранные фильтры) иногда стерилизуют длительным (в течение 30—60 мин) кипячением в дистиллированной воде. Металлические и стеклянные предметы лучше всего кипятить в специальных закрытых сосудах — стерилизаторах. Можно использовать для этой цели и металлическую посуду. Мембранные фильтры обычно кипятят в колбе или химическом стакане, закрытых ватными пробками. Однако этим способом с целью стерилизации в микробиологической практике пользуются редко в связи с тем, что длительное кипячение может повредить обрабатываемый материал, а сокращение времени кипячения может не обеспечить стерильность, так как споры некоторых анаэробных микроорганизмов сохраняют жизнеспособность даже после кипячения в течение нескольких часов. Надежность стерилизации при кипячении может быть увеличена внесением в воду какого-либо бактерицидного средства: 2%-ного формальдегида, 0,1%-ной сулемы или 1%-ной бриллиантовой зелени. Но в этом случае возможно загрязнение биоцидами стерилизуемых предметов.