ДНК-полимеразы прокариот

2014

 

 

 

Содержание

Введение……………………………………………………………………………………………………………………………3

1.Репликативная вилка………………………………………………………………………………………………………4

2.Стадии репликации………………………………………………………………………………………………………..5

2.1.Инициация…………………………………………………………………………………………………………………..5

2.2.Элонгация……………………………………………………………………………………………………………………5

2.3.Терминация…………………………………………………………………………………………………………………6

3.ДНК-полимеразы прокариот…………………………………………………………………………………………..7

Заключение……………………………………………………………………………………………………………………..10

Список литературы…………………………………………………………………………………………………………..11

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

      Генетическая  программа всех живых организмов, за исключением РНК-содержащих  вирусов, записана в нуклеотидной  последовательности ДНК. Следовательно, для сохранения уникальных свойств  организма необходимо точное  воспроизведение этой последовательности  в каждом последующем поколении. Е. соli, например, должна дуплицировать практически без ошибок полный геном размером 4·106 нуклеотидных пар при образовании каждого последующего поколения; точно так же должны быть скопированы почти 4·109 пар оснований в 23 парах хромосом человека при каждом акте деления клеток.

    Основным свойством  ДНК является то, что она служит  матрицей и определяет порядок, в котором нуклеотиды выстраиваются  в новые полинуклеотидные нити. 
   Собственно репликация ДНК в широком смысле – очень важный для делящейся клетки процесс. В него входит также подготовка хроматина к репликации и недопущение повторного митоза. Это обеспечивает однократную дупликацию ДНК в течение одного клеточного цикла, поддерживая таким образом стабильность генома. 
 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Вилка репликации    

Процесс репликации происходит в специальных структурах, названных вилками репликации. Схематическое устройство репликативной вилки E.coli представлено на рис. 1. То, что две нити молекулы ДНК расположены антипараллельно друг другу, создает ряд проблем для их олдновременной разнонаправленной репликации. 
   По мере движения вилки одновременно должны синтезироваться две дочерние цепи. Вилка движется в направлении от 5' к 3’ на одной цепи и от 3’ к 5' – на другой. Однако нуклеиновые кислоты синтезируются только от 5'– к 3'-концу. Проблема решается таким образом, что на одной из родительских нитей новая нить синтезируется непрерывно в направлении 5'-3', что совпадает с движением вилки репликации. Это называется лидирующей или ведущей. Другая нить называется отстающей или запаздывающей, так как синтез на ней идет с некоторой задержкой по сравнению с лидирующей нитью. Это связано с тем, что ДНК на этой нити синтезируется также от 5' к 3', но в направлении, противоположном движению вилки, и короткими фрагментами. Благодаря этому разнонаправленный синтез ДНК может осуществляться в рамках одной структуры – репликативной вилки.

 

 
   Рис. 1.   

Длина таких коротких фрагментов у прокариот составляет 1000–2000 пн. По имени открывшего их ученого они были названы «фрагментами Оказаки». По мере движения репликативной вилки концы соседних фрагментов Оказаки соединяются с образованием непрерывной отстающей нити. Для того, чтобы процесс на обеих нитях шел синхронно, полимеразные комплексы лидирующей и отстающей нити связаны между собой, образуя сложную трехмерную структуру  
   Вилка репликации может двигаться как в одну сторону от точки начала репликации, так и в обе стороны. В зависимости от этого процесс называется однонаправленной или двунаправленной репликацией. Как это выглядит схематически, показано на  
   Механизмы инициации репликации в точке начала репликации и при образовании фрагментов Оказаки в отстающей цепи в принципе аналогичны, хотя имеются некоторые тонкие различия. В обоих случаях происходит образование коротких РНК-затравок (праймеров), комплементарных матричной ДНК, в виде продолжения которых синтезируется новая цепь ДНК. В дальнейшем короткие вставки РНК замещаются сегментами ДНК, отдельные фрагменты Оказаки затем объединяются с образованием непрерывной  отстающей нити. 
   Клетки прокариот имеют очень небольшие размеры – около 1 мкм. Объем эукариотических клеток в 800-1000 раз больше объема клеток прокариот. К прокариотам относятся бактерии и археи (или архебактерии).(TheLib.Ru) 
  
   

2.Стадии репликации

Репликация лучше всего изучена у кишечной палочки E.coli.Реликация состоит из 3 стадий:

1.Инициация

2.Элонгация

3.Терминация

2.1 Инициация репликации у E.coli   

Инициация репликации в оriС в системе in vitro начинается с формирования комплекса, в состав которого входят шесть белков: DnaА, DnaВ, DnaС, НU, Girase и SSВ. Сначала с девятичленной последовательностью связывается мономер DnaА, затем 20–40 мономеров этого белка формируют большой агрегат. ДНК ориджина опоясывает его, и цепи ДНК разъединяются в области трех тринадцатичленных последовательностей. На следующем этапе димер DnaВ/DпаС присоединяется к комплексу oriС/DnaА, формируя агрегат размером около 480 кДа, соответствующий сфере с радиусом 6 нм. В результате формируется вилка репликации.    

Наиболее подробно изучены ориджины у Е. соli. Область начала репликации хромосомы, оriС, включает в себя участки со специфическими последовательностями, так называемыми ДНК-боксами, и расположенными между ними короткими последовательностями. ДНК-боксы со специфическим «мотивом» нуклеотидов, преимущественно в 9пн, перемежаются фрагментами в 12-13пн с высоким содержанием АТ. Сами девятичленные последовательности могут располагаться как в прямом, так и в инвертированном положении по отношению друг к другу.

     Порядок расположения ДНК-боксов, промежуточных областей и их количество позволяют думать, что эволюционная дивергенция oriС шла главным образом за счет дупликаций и трипликаций.  (Thelib.ru)

 

 

 

2.2.Элонгация репликации

Фермент ДНК-полимераза начинает синтез новых нитей ДНК с 3’ концов двух РНК-затравок . При таком синтезе дочерние молекулы ДНК на матричных нитях будут синтезироваться в противоположных направлениях. Элонгация начинается с присоединения одного нуклеотида к 3’ концу РНК-затравки. Это присоединение осуществляет фермент ДНК-полимераза.

К первому нуклеотиду ДНК-полимераза присоединяет второй, третий и т.д. нуклеотид в соответствии с принципом комплементарности к нуклеотидам, находящимся на матричной нити ДНК. Основания нуклеотидов новой нити и матричной соединяются друг с другом водородными связями. Поскольку синтез новой нити ДНК начинается с 3’ конца РНК-затравки, к которому присоединяется 5’ конецпервого нуклеотида ДНК, то принято считать, что синтез дочерней нити ДНК происходит в направлении 5’ - 3’.

На той нити, где синтез дочерней нити идёт в сторону вилки репликации, он идёт непрерывно, и по мере раскручивания нити фрагмент синтезированной ДНК будет постоянно удлиняться. Чем дальше продвигается вилка репликации, тем длиннее будет вновь синтезированная цепь ДНК. Эту нить ДНК называют непрерывной, лидирующей или ведущей. В дальнейшем никаких РНК-затравок на матричной нити ДНК, с которой реплицируется лидирующая нить, не формируется.

Сложнее происходит синтез дочерней ДНК на противоположной нити материнской ДНК, которая имеет направление 5’ - 3’. К синтезированной на этой нити РНК-затравка (на рисунке обозначена как «Б») нуклеотиды будут присоединятся также к 3’ и новая цепь будет синтезироваться в сторону от вилки репликации. Эту нить дочерней ДНК называют отстающей, запаздывающей. Таким образом, в репликативной вилке одновременно синтезируются две дочерние нити ДНК – ведущая (она синтезируется в направление вилки репликации) и отстающая (синтезируется в направлении от вилки репликации), т. е направление синтеза обоих дочерних цепей противоположно.

Синтез запаздывающей нити ДНК происходит не постоянно, а фрагментами. После окончания синтеза одного фрагмента вблизи репликационной вилки вновь происходит синтез РНК-затравки - С. С 3’ этой затравки вновь начинается синтез дочерней нити ДНК в направлении РНК-затравки – Б и по её достижению синтез вновь прекращается – сформировался второй фрагмент ДНК, который начинается от РНК-затравки – С. Фактически на отстающей цепи мы имеем два фрагмента, которые состоят из соединённых друг с другом РНК и ДНК. Один фрагмент ДНК начинается с РНК-затравки Б, второй – с РНК-зартавки С. Эти фрагменты ДНК носят название фрагмент Оказаки .Последующие раунды репликации повторяются – топоизомераза раскручивает очередной виток спирали ДНК, хелаза разрывает водородные связи между нитями ДНК и они расходятся, белки SSB фиксируют нити, лидирующая цепь продолжает удлиняться, на отстающей цепи синтезируется третий фрагмент РНК-затравки - Д и с его 3’ конца начинает синтезироваться новый фрагмент Оказаки. Затем на отстающей нити ДНК РНК-затравки разрушаются и оставшиеся фрагменты ДНК соединяются в единую цепь . Таким образом, на отстающей нити идут непрерывно 4 процесса: образования новых РНК-затравок, синтез с их 3’ конца фрагментов Оказаки, разрушение РНК-затравок и воссоединение фрагментов в единую цепь.(?)

 

 

2.3.Терминация

Терминация происходит тогда, когда встречаются две репликативные вилки про удвоении кольцевых молекул ДНК. Непрерывный рост лидирующей и отстающей цепей вдоль кольцевых матрицы неизбежно приводит к совмещению 3,-гидроксильного и 5,-фосфорильного концов одной цепи ,либо в точке начала репликации(однонаправленная репликация),либо при двунаправленной репликации- в середине кольца. Кольца в этих местах встречи соединяются ДНК –лигазой, при этом обычно они оказываются попарно сцепленными, т.е. образуют катенан. ДНК-гираза может расцепить зацепленные кольца, используя свою возможность вносить временный двуцепочечный разрыв(А.С.Коничев,Г.Ф.Севастьянова,2005).

2.4.Регуляция репликации

При каждом клеточном делении каждая молекула ДНК должна удваиться; т.е. на каждом oriС должен происходить в точности один акт инициации репликации. Существует тонкие механизмы регуляции репликации на уровне инициации новых раундов, позитивным регулятором этого процесса является белок Dna-A.Среди моделей ,объясняющих механизм регуляторного действия белка Dna-A, наиболее распростронение получила модель титрования Dna-A:весь вновь синтезируемый белок Dna-A9титруется) Dna-A-боксами oriС хромосомы . Как только количество молекул инициатора превышает число внутриклеточных Dna-A-боксов .инициируется синтез ДНК. После запуска инициации на одном oriС освобождаются молекулы Dna-A, резко повышаются его внутриклеточная концентрация и синхронная инициация синтеза ДНК на других доступных областях начала репликации. (А.С.Коничев,Г.Ф.Севастьянова,2005).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. ДНК-полимеразы прокариот   

Полимеразы прокариот обозначаются римскими цифрами (в отличие от полимераз эукариот, которые обозначаются греческими буквами). Наиболее полно изучена ДНК-полимераза I (Ро1I)Е. соli. Она представляет собой одиночный полипептид с мультифуикциональными активностями. В качестве ДНК-полимеразы Ро1I катализирует перенос 5'-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов к З'-ОН-группе в цепи ДНК или РНК, после чего происходит спаривание перенесенного основания с соответствующим основанием комплементарной цепи ДНК. Таким образом, для полимеризации ферменту необходимы праймер в качестве акцептора дезоксинуклеотида и матрица, определяющая присоединение нужного нуклеотида. Помимо полимеризации нуклеотидов, Ро1I катализирует две другие реакции, биологическая роль которых очень важна. В одной из них происходит гидролиз фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на неспаренном конце дуплексной ДНК, причем за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3'-конца цепи (3'-5'-экзонуклеаза). Вторая реакция также состоит в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз начинается с 5'-конца двунитевой ДНК в направлении к 3'-концу (5'-3'-экзонуклеаза). Эти различные активности присущи разным сайтам полипептидиой цепи РоlI, Если in vitro обработать РоlI трипсином, то полипептидная цепь расщепится на большой и малый фрагменты. Большой, С-концевой фрагмент («фрагмент Кленова») сохраняет ДНК-полимеразную и 3' -5'-экзонуклеазную активности; малый N-концевой фрагмент обладает только 5'-3'-экзонуклеазной активностью. 
   РоlI и присущие ей экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК Е. соli. 3’-5'-экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов вновь синтезированной цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем РоlI, то при репликации генома часто происходят мутации – замены оснований. 
   Способность ДНК-полимеразы удлинять 3'-конец нити, спаренной с матричной нитью, позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстающей нити. РоlI удлиняет фрагменты Оказаки с 3'-концов и удаляет рибонуклеотиды праймера, с которых начинаются 5'-концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования непрерывной отстающей цепи. Поскольку РоlI способна удлинять 3'-конец одной из цепей в месте разрыва в двунитевой ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва (процесс, называемый ник-трансляцией), этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК. Ник-трансляция широко используется in vitro для синтеза радиоактивно меченой ДНК. 
   У Е. соli имеются и две другие ДНК-полимеразы, но они присутствуют в клетке в меньших количествах. Ро1III присоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем Ро1I, и не обладает 5'-З'-экзонуклеазной активностью. Следовательно, РоlII может заполнять пробелы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не способна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. Роль РоlII в репликации и сохранении хромосомной ДНК Е. соli до настоящего момента неясна. Вероятно, она может участвовать в восстановлении синтеза ДНК после повреждения и остановки вилки репликации. Такой процесс принято называть ресинтезом. 
   PolIII-холофермент – это ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК Е. соli. В каждой клетке содержится только 10–20 копий PolIII – холофермента, но именно он является основным компонентом мультиферментного полимеразного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в элонгации лидирующей цепи в вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки. Так как PolIII – холофермент не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, для репликации отстающей цепи необходимо участие РоlI, чтобы произошло удлинение продукта, образовавшегося при участии PolIII, и удаление РНК-праймеров на 5'-конце фрагментов Оказаки. 
   Методом направленного мутационного анализа обнаружены изменения в полипептидной цепи основного (кор) фермента PolIII, и изучены аминокислотные замены, которые позволяют приписать определенные виды ферментативной активности конкретным субъединицам ферментного комплекса. Так, α-субъединица обладает полимеразной активностью, а ε-субъединица – 3' 5'-экзонуклеазной. Однако комплекс α– и ε-субъединиц обладает значительно более высокой полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей, θ-субъединицы пока неясна. 
   Помимо субъединиц, составляющих PolIII – кор, PolIII-холофермент содержит еще семь субъединиц: τ,γ,β,δ,δ’,χ, и ψ. Роль β-субъединицы заключается в том, чтобы свести к минимуму вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования, то есть работает как «зажим». Субъединица τ является фактором димеризации репликативных холоферментов. Точная же функция других субъединиц неизвестна. Вполне возможно, что PolIII-холофермент существует в двух формах, каждая из которых содержит определенный набор вспомогательных субъединиц, придающих ферменту определенные свойства. В одной форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой – прерывистой отстающей. 
   PolIII-холофермент катализирует же реакции синтеза, что и PolI, но работает примерно в 60 раз быстрее. Более того, PolIII-холофермент обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования. PolIII-холофермент может связываться и с другими белками, увеличивая эффективность процесса копирования благодаря координации некоторых важных ферментативных этапов репликации. На этом более высоком уровне организации в комплексы могут включаться белки, расплетающие спираль ДНК в точках начала репликации и в репликативных вилках (геликазы), инициирующие образование праймерных РНК (праймазы), обеспечивающие последовательное наращивание цепей ДНК, терминирующие процесс репликации и разделяющие дочерние спирали ДНК.

ДНК-полимеразы, синтезируемые другими бактериями и многими бактериофагами, различаются по своим физической структуре и свойствам. Тем не менее, катализируемые ими реакции практически идентичны реакциям, изученным у Е. соli. У всех ДНК-полимераз есть корректирующая 3'-5'-экзонуклеаза, однако 5'-3'-экзонуклеаза у большинства ферментов отсутствует. Например, ДНК-полимераза фага Т4 может осуществлять 3'-5'-экзонуклеазную реакцию и корректировать ошибки репликации, но не способна катализировать 5'– З'-экзонуклеазную реакцию и поэтому не может обеспечить ник-трансляцию. При репликации ДНК фага Т4 5'-3'-экзонуклеазную реакцию удаления РНК-праймеров перед объединением фрагментов Оказаки катализирует другой кодируемый фагом белок. В процессе прерывистого синтеза отстающих нитей и репарации повреждений ДНК фага Т4 этот фермент работает согласованно с фаговой ДНК-полимеразой. Некоторые вирусы животных (например, герпесвирус, вирус коровьей оспы и вирус гепатита) индуцируют синтез особых полимераз для репликации своих геномов. 
   Другие вирусы образуют белки, которые стимулируют системы репликации клеточной ДНК или участвуют в репликации вирусной ДНК. Например, паповавирусы синтезируют белки, необходимые для инициации репликации. Аденовирусы человека кодируют белки, «запускающие» инициацию синтеза обеих цепей линейной вирусной ДНК. Они продуцируют также особые ДНК-связывающие белки, облегчающие репликацию. (TheLib.Ru)

Электронная библиотека © 2006-2014 | Контакты | Авторам и правообладателям

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

Суть репликации ДНК заключается в том, что специальный фермент разрывает слабые водородные связи, которые соединяют между собой нуклеотиды двух цепей. В результате цепи ДНК разъединяются, и из каждой цепи «торчат» свободные азотистые основания.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы

1. Гены и геномы (том 2) Сингер М.,Берг П.

2.Молекулярная биология: Учеб. для студ.пед.вузов /А.С.Коничев,Г.А.Севастьянова.-2 изд., испр.-М.: Издательский центрАкадемия»,2005.

3. TheLib.Ru