Что такое ПЦР

ЧТО ТАКОЕ  ПЦР

1.1. ИЗОБРЕТЕНИЕ  ПЦР

В последние годы все больше молекулярно-биологических  методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов — полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая нарабатывать в пробирке определенный участок молекулы дезоксирибонуклеиновои кислоты (ДНК) практически в неограниченных количествах.

В медицине ПЦР применяют при  диагностике инфекционных и наследственных заболеваний, при диагностике рака и иммунных патологий. ПЦР используют для идентификации личности и определения биологического родства индивидов* Санитарно-эпидемиологические службы используют ПЦР для контроля за микробиологическим загрязнением окружающей среды и продуктов питания, а также для выявления генетически модифицированных источников пищи (ГМИ). В научно-исследовательских лабораториях ПЦР используют для изучения нуклеиновых кислот и проведения манипуляций с ними. Например, благодаря ПЦР стало возможным быстрое получение исследуемых участков ДНК в чистом виде и в достаточном количестве.

Открытие полимеразной цепной реакции  стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять данную область науки на качественно новый уровень. Внедрение полимеразной цепной реакции в медицину открыло новое диагностическое направление — ДНК-диагностику.

Основные принципы полимеразной реакции  и состав реакционной смеси для получения копий ДНК впервые были описаны К1ерре с соавт. в 1971 году [К1ерре е1 а1> 1971]. Однако исследователями не была продемонстрирована главная черта ПЦР — экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК.

 

Что такое  ПЦР П

„ - 4-й цикл

_{Интересующий гя«}

^{фрагмент , _ш ^ *™?,< а» Экспоненциальная}

/ ли. и тт  "*^ ..... 

(1-й цикл *мшт    *"  40 циклов = 10¹² копий

амплификация

Образец ДНК

\штш/ "—^шяэз   Цикл ПЦР:

94 °С —  10 с (денатурация ДНК) 64 °С — 10 с (отжиг праймеров) 72 °С — 10 с (синтез ДНК)

Рис. 1.1. Принцип экспоненциальной амплификации ДНК в ходе ПЦР

В 1983 году сотрудник фирмы «СеЪиз»  Кагу МиШз предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимераз-ная цепная реакция. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пцобирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ферментом ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение числа определенных фрагментов ДНК (рис. 1.1).

Следует отметить, что широкому распространению  ПЦР сопутствовало развитие некоторых  технологий. В частности, появление  приборов, позволяющих автоматически  синтезировать одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды). В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментативная система, в частности фермент ДНК-полимераза, выдерживает высокие температуры горячих источников и сохраняет свою биологическую активность после нагревания до 100 °С. Использование программируемых термоцикл еров, изменяющих температуру реакционной смеси по заданной циклической программе, и ферментов из термофильных микроорганизмов, существенно упростило проведение реакции, сделав ее рутинной процедурой.

Результатом открытия ПЦР стало  почти немедленное практическое применение метода. В 1985 году 8а0и с  соавт. опубликовали статью, в которой  была описана амплификация участка  гена р-глобина [8а1Ы е% а1> 1985]. С этого момента количество публикаций, в которых авторы сообщали о применении ПЦР в своих работах, стало увеличиваться в геометрической про-

 

₁₂ 

_{Глава 1}

грессии. Метод приобрел такую популярность, что сегодня уже трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования. На основе ПЦР были созданы современные

технологии  секвенирования (определения последовательности нуклеотидов в ДНК). В настоящее время существует множество модификаций ПЦР, одной из которых и посвящена данная работа.

1.2. ИЗОБРЕТЕНИЕ ПЦР «В РЕАЛЬНОМ  ВРЕМЕНИ»

Поскольку в ходе полимеразной цепной реакции происходит наработка определенного участка ДНК, по окончании реакции можно зарегистрировать полученный фрагмент при помощи ряда методов, первым и наиболее часто используемым из которых является метод электрофореза молекул ДНК в геле с окрашиванием бромистым этидием. Однако регистрация результата реакции по ее завершении не дает информации об эффективности процесса (если не использовать специальную постановку эксперимента), снижая тем самым потенциальную информативность ПЦР. Применение метода было ограничено задачами, в которых было достаточно ответа «да»-«нет»,

В начале 90-х годов прошлого столетия исследователи предложили регистрировать накопление ДНК непосредственно в ходе ПЦР [НгдисЫ е1 а\_% 1992]. К этой идее их подтолкнуло желание использовать метод ПЦР для количественного определения исходного числа матриц, попавших в реакционную пробирку. Несмотря на то, что ПЦР и ранее использовали для количественного определения нуклеиновых кислот, изобретение ПЦР «в реальном времени» существенно упрощало технику измерения и делало подход более точным [Н1&исЫ е1 а1> 1993].

С этого  момента началось бурное развитие как  приборной, так и реагентной базы для выполнения ПЦР с регистрацией накопления продуктов амплификации непосредственно в ходе реакции (рис. 1.2). Уже в середине 90-х годов появились первые детектирующие амплификаторы (термоциклеры), а к настоящему моменту их разнообразие перевалило за 30 (на рынке присутствует более 10 компаний, промышленно выпускающих приборы данного типа).

Можно с уверенность констатировать быстрое замещение обычной ПЦР  методиками с флуоресцентной регистрацией накопления ДНК в области выявления и количественного определения нуклеиновых кислот. В первую очередь это связано с удобством процедуры за счет отсутствия отдельной стадии де-

 

_{Что такое ПЦР} 

₁₃

Изобретение * классической» ПЦР

Расцвет «классической» ПЦР, изобретение «флуоресцентной» ПЦР

Расцвет «флуоресцентной» ПЦР

 

 

₁₉₈₃ 

₁₉₉₃ 

₂₀₀₃

^{Рис. 1.2. Этапы развития метода ПЦР}

текции результатов ПЦР. Кроме  того, флуоресцентные методы позволяют  избирательно регистрировать амплификацию лишь определенных фрагментов ДНК (за счет использования олиго-нуклеотидных проб), повышая тем самым достоверность  исследования. Вместе с тем, обычная ПЦР сохраняет свои позиции в методиках, требующих наработки фрагментов ДНК с целью их дальнейшего использования (клонирования, определения последовательности и т. п.). Здесь дополнительные компоненты реакции (интеркалирующие красители, пробы) могут помешать последующим процедурам и их лучше исключить из состава реакционной смеси (рис. 1.3).

 

 

Получение информации 

Получение материи

 

анализ уровня представленности транскриптов Ы Ши ПЦР

ДНК-диагностика  в медицине генотипирование 

 

• ^{клонирование  ДНК}
• вычитающая гибридизация —дифференциальный дисплей
• 1п иИго мутагенез и др.

Рис. 1.3. Разделение ПЦР  по принципу решаемой задачи. ПЦР «в реальном времени» наилучшим образом подходит для «информационной» ПЦР

 

₁₄ 

_{Глава 1}

1.3. ОТЛИЧИЕ АНАЛИЗА ПРОДУКТОВ  ПЦР «ПО КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ» И  «В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ»

Регистрировать результат ПЦР  можно либо по завершении амплификации («по конечной точке»), либо на протяжении всей реакции («в реальном времени»), «Классическая» ПЦР предполагает анализ результатов  реакции «по конечной точке». Для этого используют методы электрофореза в геле, гиб-ридизационно-ферментный анализ (ГиФА), флуоресцентную детекцию после ПЦР (ГЬАЗН) и др. Все эти подходы показывают количество продукта реакции в определенный момент течения процесса (обычно — по завершепии процесса), давая исследователю лишь статичную картинку динамичного процесса. Электрофореграмму агарозного геля по информативности для исследователя можно сравнить фотографией фигуриста» по которой судьи должны выставить оценки за технику и артистичность всего выступления.

При регистрации накопления продуктов  амплификации на протяжении всего процесса, исследователь получает гораздо  больше информации об особенностях реакции. Продолжая аналогию, можно сказать, что ПЦР «в реальном времени» — это киносъемка выступления фигуриста. Зная кинетику процесса, можно уже оценивать начальные параметры реакции и сравнивать реакции между собой.

Приведем такой пример: среди  исследователей, использующих ПЦР для оценки уровня представленности транскрип-тов, часто можно встретить суждение, что чем больше продукта реакции видно на электрофореграмме, тем больше матриц было добавлено в реакцию на старте. На рисунке 1.4 приведен результат эксперимента, в котором в параллельные реакции было добавлено одинаковое количество стартовых молекул ДНК. Анализ электрофореграммы показывает, что в реакциях получено разное количество продукта ПЦР. Однако кривые накопления продукта амплификации ярко демонстрируют схожую начальную концентрацию матриц.

1.4. РАЗВИТИЕ ПЦР «В РЕАЛЬНОМ  ВРЕМЕНИ» КАК ДИАГНОСТИЧЕСКОГО  ИНСТРУМЕНТА

Переход любого метода из научно-исследовательской  лаборатории в лабораторию диагностическую сопряжен с рядом возникающих на этом пути проблем: уровень специальной подготовки сотрудников диагностической лаборатории принц- 

ииально отличается от подготовки сотрудников  научно-исследовательского института. В медицинской диагностике гораздо выше требования к воспроизводимости получаемых результатов, трактовка результатов исследования должна быть стандартизована и автоматизирована и т. д.

В этой связи можно сформулировать основные направления развития ПЦР в ближайшем будущем.

1. Повышение общей надежности метода.
2. Дальнейшее упрощение процедуры анализа.
3. Сокращение времени исследования.
4. Широкое внедрение количественной ПЦР.

Эти тенденции будут реализованы  за счет использования флуоресцентных методов детекции продуктов амплификации, автоматизации и применения компьютерных методов регистрации и трактовки результатов исследования.

Уже сейчас техника выполнения процедур при проведении I ЩР-диагностики довольно проста. В клинической лабораторной диагностике исследование принято подразделять на три ;>тапа: пробоподготовка (очистка ДНК или РНК исследуемого объекта от примесей), амплификация определенного фрагмента ДНК и регистрация результатов амплификации. Развитие

 

_н* 

_{Глава 1}

методик пробоподготовки можно  прогнозировать в направлении повышения  эффективности лизиса и удаления ингибиторов и автоматизации процесса. Некоторые образцы биоматериала содержат агенты, существенно снижающие эффективность реакции. При проведении количественного ПЦР-анализа отличие в эффективности амплификации может внести существенную ошибку, поэтому с распространением количественного анализа требования к чистоте получаемой ДНК повышаются. Для этапа амплификации стоит отметить тенденцию к переходу от использования отдельных реакционных пробирок к стандартным форматам скрепленных пробирок (8- или 12-луночные стрипы и 96- или 384-луночные планшеты). При этом возможность использования многоканальных пипеток и дозаторов ускоряет процедуру приготовления реакционной смеси. Крупные диагностические центры, при использовании планшетных форматов, могут применять роботизированные дозирующие станции, снижающие вероятность ошибки лаборанта.

Достоверность исследования в значительной мере связана со способом детекции и интерпретации результатов  ПЦР (см. табл. 1.1). В настоящее время  можно выделить четыре системы детекции результатов ПЦР, наиболее часто  применяемых в диагностических лабораториях: гель-электрофорез, гибридиза-ционно-ферментный анализ (ГиФА), флуоресцентная детекция результатов после ПЦР (ГЪАЗН) и флуоресцентная детекция во время ПЦР (ПЦР «в реальном времени»). Последние два метода отличаются тем, что продукт амплификации для определения не извлекается из пробирки, а регистрация результатов (измерение флуоресценции) идет в закрытой пробирке. Тем самым решается одна из ключевых проблем внедрения ПЦР в медицинскую лабораторную практику — проблема контаминации (см. гл. 2).

Применение системы детекции результатов  ПЦР в режиме «реального времени», наряду с ответом на вопрос о наличии  или отсутствии в исследуемом  образце мишени, позволяет оценить его количество, что в ряде случаев позволяет уточнить диагноз и выбрать более адекватный метод лечения.

Современные компьютерные программы  в комбинации с применением флуоресцентно-меченных гибридизационных олигонуклеотидных  проб для визуализации результатов  ПЦР (методы РЪА8Н или ПЦР «в реальном времени») позволяют практически  полностью исключить неверную трактовку  результатов. Автоматизированная система фиксирования дa 

 

с детектирующего амплификатора или специализированного  флуориметра в памяти персонального  компьютера позволяет вести эффективную  документацию и хранение информации с возможностью выведения отчета о проведенном анализе в стандартном  виде.