Біофізика

План 

 

Фітобіологічні процеси і їх стадії

Вивчення біофізичних  аспектів фото біологічних процесів є центральним розділом квантової біофізики. До фото біологічних відносять процеси, що починаються з поглинання кванта світла біологічно важливою молекулою і що закінчуються якою-небудь фізіологічною реакцією (позитивною або негативною) на рівні організму. До таких процесів відносяться:

Фотосинтез - синтез органічних молекул  за рахунок енергії сонячного  світла;

Фототаксис - рух організмів, наприклад  бактерій, до світла або від світла;

Фототропізм - поворот листя або  стебел рослин до світла або від світла;

Зір - перетворення світлової енергії на енергію нервового імпульсу в сітківці ока або в аналогічних фоторецепторах;

Дія ультрафіолетових променів (бактерицидна або бактеріостатична дія на мікроорганізми, мутагенна дія, канцерогенна дія, утворення вітаміну D з провітамінів, єритемне дія на шкіру, утворення загару, терапевтичні ефекти).

До фото біологічних процесів також може бути віднесена біохімілюмінесценція(см. гл. 9). (Тут, навпаки, певні біохімічні реакції супроводжуються появою електронно-збудженого продукту з наступним випусканням кванта люмінесценції.)

Фітобіологічні процеси дуже різноманітні. Кожен з них складається з багатьох стадій, починаючи з акту поглинання кванта світла і кінчаючи фізіологічними реакціями на рівні цілого організму. Умовно всякий фотобіологічний процес можна розбити на декілька стадій: 1) поглинання кванта світла, 2) внутрішньомолекулярні процеси розміну енергією (фотофізичні процеси); 3) міжмолекулярні процеси перенесення енергії збудженого стану; 4) первинний фотохімічний акт; 5) темнових реакцій, що закінчуються утворенням стабільних продуктів; б) біохімічні реакції за участю фотопродуктів; 7) загальнофізіологічна відповідь на дію світла.

У справжній книзі будуть розглянуті переважно початкові, фізико-хімічні стадії фотобіологічних процесів. Перші три стадії фотохімічного процесу однакові для процесів фотохімії і люмінесценції; тому закони фотохімії мають свої аналоги із законами люмінесценції (см. гл. 3). Первинний фотохімічний акт - це процес, в який вступає молекула з нижнього синглетного S0 або триплетного t! збудженого стану.

Квантовий вихід Q - це відношення числа молекул, що прореагували, до поглинених фотонів. У разі первинних стадій

фотохімічних реакцій квантовий  вихід дорівнює відношенню числа збуджені молекул речовини, вступаючих у фотохімічний процес, до загального числа збуджених молекул :

(* (продукти реакції)

(* (перехід молекули в основний стан)

(Рисунок 1)

У реальних умовах досвіду квантовий вихід можна визначати, вимірюючи спад початкової речовини АА або накопичення продукту реакції АР за кінцевий час t під дією опромінення об'єкту монохроматичним світлом з інтенсивністю J Ейнштейн/с):

(Рисунок 2)

де (1-Т) коофіцієнт поглинання; Jt - доза опромінення; Jt (l - Т) –загальна кількість поглинених фотонів (Ейнштейн).

Визначуваний в досвіді квантовий вихід Q залежить від умов експерименту. Так, поглинання діючого світла продуктами реакції або сторонніми речовинами знижуватиме Q, а розвиток ланцюгових реакцій, що ініціюються радикалами, що первинно утворилися, може привести до високих квантових виходів утворення продуктів реакції (значно більше одиниці. Для розуміння механізму фотохімічного процесу особливо важливий квантовий вихід первинної реакції, визначуваний по рівнянню 4.1).

Фотохімічний спектр дії

Одне із завдань при вивченні фотобіологічних процесів – визначення речовини, яка поглинає діюче випромінювання і тим самим бере участь в перших стадіях процесу. Для цього вивчають спектр фотохімічної дії і порівнюють його із спектрами поглинання передбачуваних учасників реакції. Суть такого підходу ми пояснимо на прикладі фотохімічної інактивації ферментів при ультрафіолетовому опроміненні. Особливість цієї реакції полягає в тому, що вона протікає по одинударному механізму : під дією поглиненого кванта молекула або зовсім не змінюється, або повністю інактивується; вірогідність інактивації і квантовий

вихід інактивації Q.

Розглянемо кінетику цього процесу. Нехай в кюветі з перерізом S (см2) і завтовшки / см знаходиться розбавлений розчин ферменту в

концентрації n молекул  в 1 см3 (см~3), усього в кюветі знаходиться nSl

молекул. Нехай, далі, на кювету падає потік квантів світла jq (смГ2-с~1), який ослабляється на виході з кювети до величини J.

Потік квантів світла, що падають на розчин, очевидно, рівний jq$.

Кожну секунду розчин поглинатиме*фотонів

де T = J/J() - коефіцієнт пропускання. При цьому в розчині щомиті інактивується

(Рисунок 3)

молекул, де Q - квантовий  вихід фотохімічної реакції.

Величини J, jq, S і / пов'язані між собою за законом Бугера - Ламберта Бера

чи в іншій формі: * (1-5) -

де D - оптична щільність розчину, А - absorbency, £ - молярний коефіцієнт поглинання, S - поперечний переріз поглинання молекули, З - концентрація в мілі/літр, П - концентрація в числі молекул в 1 см3.

З рівнянь (4.3) і (1.5) знаходимо

(Рисунок 4)

У розбавлених розчинах, де nSl " 1, вираження в дужках (4.4) приблизно рівний nSl (погрішність <5% при nSl < 0,1).

Тоді можна написати, що*(4.5)

Рішення рівняння (4.5) дає*

(Рисунок 5)

де Д - доза опромінення, G = Qs - поперечний переріз інактивації

ферменту, має розмірність  площі.

Для визначення G будують  графік залежності ІШ2 =/(мал. 4.1); величина G визначає нахил прямої. Оскільки при  П(/П =Є 1їі(й(/й) = 1, можна знайти G безпосередньо з дозової кривої

інактивації: G = 1/Дз7, де Д37 - доза опромінення, при якій залишилися неушкодженими 37% молекул.

(Рисунок 6)

Мал. 4.1. Визначення поперечного перерізу інактивації ферменту : ао і А{- активності ферменту перед опроміненням і після опромінення дозою Д .

При значній оптичній щільності розчину потрібне його постійне

перемішування, але проте кожна молекула поглинає менше світлової енергії в одиницю часу через екрануючу дію інших молекул в розчині. У разі суміші речовин А і В, в якій оптична щільність зразка В не змінюється

в ході опромінення, рівняння (4.3) ускладнюється і приймає вид [порівняй рівняння (2.10)]

(Рисунок 7)

де da оптична щільність  речовини, що бере участь у фото хімічної реакції.

Підставимо в рівняння (4.7)*замість D&r розділимо змінні і проінтегруємо; отримуємо

(Рисунок 8)

де До - константа, що враховує екранування фотолізуємого речовини.

(Рисунок 9)

4.2. Спектр дії  фото-інактивації (7) і спектр поглинання трипсину (2)

При потрібній довжині  хвилі слід виміряти оптичну щільність D, розрахувати коефіцієнт екранування і потім знайти G з рівняння (4.8).

У фотохімії спектром дії

називають залежність G від  довжини хвилі діючого світла (мал. 4.2).

Як і квантовий вихід  люмінесценції, квантовий вихід  фотохімічних реакцій органічних молекул  в розчинах не залежить від довжини  хвилі діючого світла. Це було експериментально підтверджено ще в роботах О. Варбурга і співробітників, які досліджували дію світла на білкові системи. Оскільки Q від довжини хвилі не залежить, то, оскільки <5 = sQ, спектр дії

ОС (А,) для індивідуальної речовини за формою відповідає спектру

його поглинання s (А,). Вимірявши (у розбавлених розчинах) по дозових кривих спектр дії, можна визначити спектр поглинання що бере участь в процесі речовини, не проводячи ніяких вимірів спектрофотометрій. Саме це і обумовлює інтерес до реєстрації спектрів дії у фотобіології.

Порівняно простий випадок - визначення спектрів дії

(Рисунок 10)

Мал. 4.3. Спектр дії виникнення мутації у кукурудзи:

- оптична щільність, (О)  ефективність УФ-индукции мутацій

фотоінактивації білків. На мал. 4.2 представлений спектр дії фотоінактивації трипсину. У трипсині є три головних хромофора - залишки триптофану, Тирозину і цистину , які і обумовлюють спектр поглинання. Як видно із спектру дії, для інактивації білку вагомий фотоаналіз усіх трьох амінокислот, оскільки спектр дії близький сумарному спектру поглинання цих амінокислот.

Так само було встановлено, що крива загибелі бактерій під дією ультрафіолету має максимум в області 265 нм і форма цієї кривої нагадує спектр поглинання нуклеїнових кислот (Ф.Л. Гейтс, 1930). Тому був зроблений висновок, що загибель бактерій під дією УФ-випромінення пов'язана з ушкодженням нуклеїнових кислот. Аналогічне спостереження було зроблене при вивченні мутагенної дії ультрафіолету. Спектр дії (мал. 4.3) виникнення мутацій біля кукурудзи опинився ідентичним спектру

поглинання нуклеїнових кислот (Л.Дж. Стадлер, 1942).

У разі складних фотобіологічних процесів, коли кінцевому ефекту передують частково оборотні фотохімічні процеси і темнові стадії, рівняння (4.6) може не дотримуватися, і неясно, як визначити

Про для побудови спектру дії. Зазвичай в цьому випадку по ординаті відкладають величину ефективності

(Рисунок 11)

Мал. 4.4. Спектр дії УФ-єритеми шкіри людини

світла Э, зворотну дозі Дс, що викликає певний фотобіологічний ефект, однаковий для усіх довжин хвиль, :

На мал. 4.4 по осі ординат  відкладена саме така величина - 1/МЭД, МЭД - мінімальна єритемна доза, тобто доза опромінення, що викликає мінімальну еритему, що виявляється. Подібну величину використовують при побудові спектрів дії загару людини, фототропізму і фототаксису рослин, чутливості ока і так далі

При вивченні спектрів дії  в складних біологічних системах може відбуватися ускладнення порівняно простої ситуації, викладеної вище, за рахунок ефектів екранування. Суть екрануючого ефекту полягає в тому, що частина світу, що падає на об'єкт, поглинається у верхніх шарах цього об'єкту, і в глибині інтенсивність діючого світла виявляється нижче в порівнянні з інтенсивністю світла, що падає, вимірюваною експериментатором. Прикладом можуть служити фотобіологічні процеси, що протікають в шкірі людини і тварин. До хромофорів в клітинах доходить світло

ослаблений поверхневими шарами шкіри (наприклад, роговим шаром), тобто має місце оптичне

екранування, яке спотворюватиме реєстрований спектр дії еритеми (мал. 4.4).

(Рисунок 12)

Мал. 4.5. Спектр дії фотоперіодичної стимуляції статевого дозрівання качат :

Sw / Sa - відношення розмірів семенників у кінці і початку досвіду (1); спектр пропускання (2) тканин голови качат з боку очних орбіталей до гіпоталамуса (фоторецептора)

На мал. 4.5 зображений спектр дії фотоперіодичної стимуляції статевого дозрівання качат, здійснюваний через фотостимуляцію гіпоталамуса. Тут

екранування проявляється особливо сильно, оскільки перш ніж дійти до гіпоталамуса, світло повинне пройти через тканини голови. Максимум спектру знаходиться в області найкращого пропускання - в червоному світлі. Визначення спектру дії в цьому фотобіологічному процесі дозволило дати практичні рекомендації по режиму освітлення.

Зміна властивостей молекул в електронно-збудженому стані

Властивості молекул  в збудженому і основному станах відрізняються по багатьох параметрах.

І. У органічних молекул з системою зв'язаних подвійних зв'язків при збудженні змінюється просторова структура. У незбудженому стані обертання двох частин молекули навколо подвійного зв'язку неможливе і такі молекули мають

плоску конфігурацію. Найменшу енергію молекула має при  перекриванні тс-орбіталей , тому тс-орбіталі називають такими, що зв'язують. Збуджені стани в перший момент після поглинання фотона зберігають плоску конфігурацію основного стану (принцип Франка-Кондона). Але збуджені 71-орбіталі є такими, що розпушують: найменшу енергію має конформація, в якій тс-зв’язок розривається і дві частини молекули обертаються навкруги о-зв’язку на 90°. Цей процес має велике значення при фотохімічних перетвореннях зорового пігменту родопсину (см. Гл. 8).

2. Відбувається зміна дипольного моменту молекул (см розд. 2.6).

3. Зміну кислотно-основних  властивостей молекул при збудженні  вивчають, використовуючи різні  методи титрування. Зазвичай диссоційована і недиссоційована форми молекул мають різні спектри поглинання і люмінесценції. Вимірюючи спектри поглинання або люмінесценції при різних pH, можна, таким чином, визначати криві дисоціації молекул. Оскільки поглинає світло молекула в основному стані, спектрофотометрично визначають криву дисоціації незбуджених молекул.

Висвічення кванта люмінесценції  походить із збудженого (синглетного  або триплетного) стану, тому люмінесцентним методом реєструють криву дисоціації молекул у збудженому стані. Виявляється, що ці криві дисоціації відрізняються один від одного (мал. 4.6). Для триптофану в області pH 9-10, тобто там, де дисоціюють аміногрупи, виразно видно різниця у величинах