Молекулярно-биологические методы: гибридизация НК, ПЦР, секвенирование ДНК

СРС. 
«Молекулярно-биологические методы: гибридизация НК, ПЦР, секвенирование ДНК».

 

Подготовила: студентка 279 группы ОМФ Утеуова А.А.

Проверила: преподаватель Николаева А.Б.

 

Карагандинский Государственный Медицинский Университет

 

Караганда 2013 год

План:

 

• Введение
• Строение ДНК
• Центральная догма молекулярной биологии
• Разрезание и сшивание
• Рестрикционные эндонуклеазы
• ДНК-лигазы
• Разделение молекул ДНК: электрофорез в геле
• Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг
• Клонирование ДНК
• Репликация в бактериях
• Полимеразная цепная реакция
• Естественные клеточные процессы in vitro
• Секвенирование ДНК
• In vitro-мутагенез
• Системная РНК-интерференция
• Изучение экспрессии генов: ДНК-микрочипы
• Литература

 

Строение  ДНК

 

• 1953 год – открытие структуры ДНК Д.Уотсоном и Ф.Криком
• Схема строения двуцепочечной молекулы ДНК:

Центральная догма молекулярной биологии 

 

• Генетическая информация при реализации передается от нуклеиновых кислот к белку, но не наоборот. А точнее, возможно передача ДНК → ДНК (репликация), ДНК → РНК (транскрипция) и РНК → белок (трансляция). Так же существуют значительно реже реализуемые пути, свойственные некоторым вирусам: РНК → ДНК (обратная транскрипция) и РНК → РНК (репликация РНК).
• Во второй половине XX века получили развитие технологии рекомбинантной ДНК (то есть, методы манипуляции ДНК, позволяющие различными способами изменять последовательность и состав нуклеотидов в молекуле).

Разрезание  и сшивание

 

• Рестрикционные эндонуклеазы

 

   Рестриктазы – это ферменты, которые используют некоторые виды бактерий. При добавлении в среду чужеродной ДНК  они способны разрушать ее, в то время, как собственная ДНК остается невредимой.

 

   К 2007 году было открыто более  3000 рестриктаз, и их открытие продолжается и по сей день.

На рисунке представлены сайты  рестрикции.

• ДНК-лигазы

 

   Для создания новых молекул ДНК, разумеется, кроме разрезания, необходима еще и возможность сшивания двух цепей. Это делают с помощью ферментов, называемых ДНК-лигазами, которые сшивают сахаро-фосфатный остов двух цепей ДНК. Поскольку по химическому строению ДНК не отличается у разных организмов, можно сшивать ДНК из любых источников, и клетка не сможет отличить полученную молекулу от своей собственной ДНК.

 

  
 
 
Разделение молекул ДНК: электрофорез в геле 

 

• ДНК помещают в гель , который помещают в постоянное электрическое поле. Из-за этого молекулы ДНК будут двигаться к аноду. После электрофореза смеси фрагментов разных длин в геле образуют полосы, соответствующие фрагментам одной и той же длины. С помощью маркеров можно установить длину молекул в образце
• Визуализовать результаты фореза можно двумя способами. 1. Добавление в гель веществ, флуоресцирующих в присутствии ДНК. 2. Использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. На гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения (авторадиографией).

Схема проведения электрофореза ДНК в агарозном геле.

Электрофорез  в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете (слева). Вторая слева дорожка — маркер с известными длинами фрагментов. Справа — Установка для проведения электрофореза в геле.

Выявление определенной последовательности ДНК  в смеси. Саузерн блоттинг

Клонирование ДНК

 

 Существует 2 основных метода: использование быстро делящихся организмов (обычно E.coli или дрожжей Saccharomyces serevisiae) или проделать аналогичный процесс, но in vitro с помощью полимеразной цепной реакции.

 

• Репликация в бактериях

Поскольку при каждом клеточном  делении бактерии удваивают свою ДНК, это можно использовать для умножения количества необходимой нам ДНК. Для того, чтобы внедрить наш фрагмент ДНК в бактерию, необходимо «вшить» его в спец.вектор, в качестве которого обычно используют бактериальную плазмиду.

В плазмидах обязательно содержится точка начала репликации, целевая последовательность рестриктазы и ген, позволяющий отобрать те клетки, которые обладают этой плазмидой. В некоторых случаях (изучение очень больших фрагментов ДНК) используют не плазмиду, а искусственную бактериальную хромосому.

 

 

Схема клонирования ДНК.

 Репликация ДНК-

 

важнейший для живых организмов процесс, основа множества молекулярно-биологических методов. Поскольку каждая из цепей ДНК содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную другой цепи, при удвоении ДНК цепи расходятся, а затем каждая цепь служит матрицей, на которой выстраивается комплементарная ей новая цепь ДНК. В результате образуются два дуплекса ДНК, каждый из которых является точной копией первоначальной молекулы.

Полимеразная  цепная реакция (ПЦР)

 

• ПЦР — молекулярно-биологический метод, позволяющий добиться колоссального (до 10¹² раз) увеличения числа копий определенного фрагмента ДНК in vitro. Она была изобретена Кэри Муллисом в 1983 г.

 

• Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. При этом происходит копирование только того участка ДНК, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от репликации ДНК в клетках живых организмов, с помощью ПЦР амплифицируют сравнительно короткие участки ДНК (обычно, не более 3000 пар нуклеотидов, однако есть методы позволяющие «поднимать» до 20 тысяч пар нуклеотидов — так называемый Long Range PCR).

 

• Фактически, ПЦР является искусственной многократной репликацией фрагмента ДНК

 

 

Схема ПЦР

Как же работает ПЦР?

 

• Изначально в реакционной смеси находятся: ДНК-матрица, праймеры, ДНК-полимераза, свободные нуклеозиды, и некоторые др.вещества, улучшающие работу полимеразы.
• Чтобы синтезировать ДНК, необходимо, чтобы один из праймеров образовал с ней водородные связи («отжегся» на ней). Сначала необходимо расплавить ДНК, — разрушить водородные связи. Делают это с помощью денатурации. Но теперь и праймеры из-за высокой температуры не могут отжечься на матрице! Тогда температуру понижают, праймеры отжигаются, после чего температуру немного поднимают. Полимераза начинает синтезировать комплементарные матрице цепи ДНК — элонгация. После одного такого цикла количество копий необходимых фрагментов удвоилось. Однако ничто не мешает повторить это еще раз. И не один, а несколько десятков раз! И с каждым повтором количество копий нашего фрагмента ДНК будет удваиваться, ведь новосинтезированные молекулы тоже будут служить матрицами.
• Увидеть результаты ПЦР очень просто: достаточно провести электрофорез реакционной смеси после ПЦР, и будет видна яркая полоса с полученными копиями.
• Чтобы избежать сильного испарения воды из реакционной смеси, в нее добавляют масло и/или используют нагревающуюся крышку термоциклера . Он быстро меняет температуру пробирок, и их не приходится постоянно перекладывать. Для предотвращения неспецифического синтеза еще до нагрева и собственно начала циклов, часто использую ПЦР с «горячим стартом».  Иногда же используют модифицированные полимеразы, которые не работают при низкой температуре.

С каждым  циклом ПЦР количество целевой ДНК  удваивается.

•  ПЦР «в реальном времени». Можно прямо в ходе реакции наблюдать за накоплением продуктов ПЦР (по флуоресценции). Соответственно, для проведения ПЦР «в реальном времени» нужен спец.прибор, способный возбуждать и считывать флуоресценцию в каждой пробирке. Самое простое решение — добавить в пробирку те же самые вещества, которые флуоресцируют в присутствии ДНК.
• Самой популярной реализацией такого подхода является метод выщепления флуорофора за счет разрушения зонда
• В реакционной смеси должен присутствовать специальный одноцепочечный ДНК-зонд: молекула ДНК, комплементарная последовательности амплифицируемого фрагмента, расположенной между праймерами. При этом к одному его концу должен быть химически приделан флуорофор, а к другому — гаситель . Когда такой зонд находится в растворе или комплементарно связан с целевой последовательностью, флуорофор и гаситель находятся относительно недалеко друг от друга, и флуоресценции не наблюдается. Однако за счет 3´-экзонуклеазной активности, которой обладает Taq-полимераза, зонд при синтезе второй цепи разрушается, флуорофор и гаситель за счет диффузии удаляются друг от друга, и появляется флуоресценция. Анализируя графики роста флуоресценции, можно много понять о протекании ПЦР, но, самое важное, можно узнать, сколько ДНК-матриц было изначально: это т.н. количественная ПЦР ( qPCR)

Естественные  клеточные процессы in vitro

 

Все основные молекулярно-биологические  процессы могут быть легко проведены in vitro (т.е., в пробирке). Пример приведен выше: ПЦР — это аналог репликации ДНК. Эти методы широко применяются в различных областях биологии, когда необходимо, например, получить чистую РНК определенного гена. В этом случае нужно сначала провести обратную транскрипцию его (гена) мРНК, с помощью ПЦР амплифицировать ее, а затем с помощью in vitro-транскрипции получить много мРНК. Первая стадия необходима из-за того, что перед образованием зрелой мРНК в клетке проходит сплайсинг и процессинг РНК — подготовка к работе матрицей для синтеза белка. Иногда этого удается избежать, если вся кодирующая последовательность гена расположена в одном экзоне.

Секвенирование ДНК

 

•  Секвенирование - определение собственно нуклеотидной последовательности цепи в молекуле. Широко применяется в медицине как метод поиска наследственных заболеваний и изучения инфекций. Все методы можно разделить на 2 категории: «классические» и нового поколения.
• Преимущество: длина прочтения, которое можно получить за один раз, у него — до 1000 нуклеотидов. В то же время у самого «хорошего» в этом плане «нового» метода секвенирования -пиросеквенирования — этот параметр не превышает 500 нуклеотидов^.
• Метод, реализованный в секвенаторах Illumina: подготовка библиотеки фрагментов (1), создание кластеров (2) и секвенирование (3).

 

1. Сначала создается библиотека фрагментов ДНК из секвенируемого генома. ДНК с помощью ультразвука или специального фермента расщепляется на произвольные фрагменты длиной в несколько сотен нуклеотидов, из которых выбираются обладающие заданной длиной (выбирается экспериментатором). После этого к ним с двух концов ковалентно присоединяются различные адаптерные последовательности  

2. Этот  раствор поступает на специальный микрочип с «пришитыми» к нему фрагментами ДНК, комплементарными адаптерным последовательностям, — праймерами. Там участки геномной ДНК прикрепляются с помощью адаптерных последовательностей к молекулам ДНК на чипе. С помощью ДНК-полимеразы у всех таких фрагментов достраивается вторая комплементарная цепь, которая будет уже ковалентно связана с праймером. Она случайно изгибается, и в какой-то момент попадет на праймер, комплементарный ее адаптерной последовательности. Они свяжутся, и снова достроится вторая цепь. Это повторяют несколько раз, после чего один из типов праймеров отрезают от молекулы ДНК, чтобы в образовавшемся кластере остались только одинаковые цепи. Всего на чипе образуются сотни миллионов таких кластеров;  

3. Собственно  секвенирование. К кластерам добавляют праймеры, комплементарные одной из адаптерных последовательностей, с которой они связываются. Затем добавляют ДНК-полимеразу и специально модифицированные нуклеотиды с прикрепленным к ним флуорофором, синтез после которых заблокирован. Они присоединяются к молекулам ДНК в соответствии с правилом комплементарности. Затем камера сканирует, какой флуорофор появился в каждом кластере по цвету свечения в лазере, и компьютер запоминает расположение кластеров. По этому определяется, какой нуклеотид встроился в цепь. После этого отщепляются флуорофоры от всех нуклеотидов, и дальнейший синтез цепи разблокируется. Все повторяется снова: добавляются нуклеотиды, чип сканируется, чтобы определить, какой нуклеотид присоединился к какому кластеру и т.п. (рис. 13). Таким образом секвенируют до 100 нуклеотидов в каждом кластере, а всего их сотни миллионов — в итоге это десятки миллиардов пар нуклеотидов.

 

In vitro-мутагенез

 

• Сайт-специфичный мутагенез. Изменение конкретного нуклеотида в последовательности. Для его использования сначала необходимо клонировать этот ген в плазмиде. После этого нужно провести как бы ПЦР с одним праймером. Причем этот праймер должен как раз включать в себя последовательность, которую мы хотим изменить — уже в нужном нам виде.  

Системная РНК-интерференция