Методы исследования структуры клетки

 

Содержание

      Введение ……………………………………………………………………………………………………… 3

1. Понятие клетки и история открытия ……………………………………………………… 3
2. Клеточная теория ………………………………………………………………………………….. 5
3. Методы исследования структуры клетки ……………………………………………. 6

Заключение ……………………………………………………………………………………………….. 20

Список используемой литературы ………………………………………………………….. 21

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Введение

  Клетки очень малы  по размеру и сложно устроены: трудно рассмотреть их структуру, трудно определить молекулярный  состав и еще труднее установить, как функционируют их отдельные  элементы. Для изучения клеток  разработано множество экспериментальных  методов, возможности которых определяют  уровень наших знаний в этой  области. Успехи в изучении биологии  клетки, включая наиболее удивительные  достижения последних лет, как  правило, связаны с применением  новых методических подходов. Поэтому  для понимания клеточной биологии  необходимо иметь некоторое представление  о соответствующих экспериментальных  методах.

Цель работы - рассмотрение современных методов, используемых для изучения клеток. Отправной точкой станет микроскопия, поскольку клеточная биология началась со световой микроскопии, и этот метод до сих пор остается весьма эффективным инструментом исследования, наряду с более современными устройствами для получения изображения, основанными на электронных пучках или иных формах излучения. Также рассмотрим, как клетки различных типов могут быть отделены от ткани и при этом сохранять способность расти, узнаем, как клетки можно разрушить, а клеточные органеллы и составляющие их макромолекулы выделить в чистом виде.

 

  1. Понятие  клетки и история открытия

  Клетка — элементарная  единица строения и жизнедеятельности  всех организмов (кроме вирусов, о которых нередко говорят  как о неклеточных формах жизни), обладающая собственным обменом  веществ, способная к самостоятельному  существованию, самовоспроизведению  и развитию. Все живые организмы  либо состоят из множества  клеток (многоклеточные животные, растения  и грибы), либо являются одноклеточными  организмами (многие простейшие и бактерии). Раздел биологии, занимающийся изучением строения и жизнедеятельности клеток, получил название цитологии. В последнее время принято также говорить о биологии клетки, или клеточной биологии.

  Первым человеком, увидевшим  клетки, был английский учёный  Роберт Гук. В 1665 году, пытаясь понять, почему пробковое дерево так  хорошо плавает, Гук стал рассматривать  тонкие срезы пробки с помощью  усовершенствованного им микроскопа. Он обнаружил, что пробка разделена  на множество крошечных ячеек, напомнивших ему соты в ульях  медоносных пчел, и он назвал  эти ячейки клетками (по-английски  cell означает «ячейка, клетка»).

  В 1675 году итальянский  врач М. Мальпиги, а в 1682 году — английский ботаник Н. Грю подтвердили клеточное строение растений. О клетке стали говорить как о «пузырьке, наполненном питательным соком». В 1674 году голландский мастер Антоний Ван Левенгук с помощью микроскопа впервые увидел в капле воды «зверьков» — движущиеся живые организмы (инфузории, амёбы, бактерии). Также Левенгук впервые наблюдал животные клетки — эритроциты и сперматозоиды. Таким образом, уже к началу XVIII века учёные знали, что под большим увеличением растения имеют ячеистое строение, и видели некоторые организмы, которые позже получили название одноклеточных. В 1802—1808 годах французский исследователь Шарль-Франсуа Мирбель установил, что все растения состоят из тканей, образованных клетками. Ж. Б. Ламарк в 1809 году распространил идею Мирбеля о клеточном строении и на животные организмы. В 1825 году чешский учёный Я. Пуркине открыл ядро яйцеклетки птиц, а в 1839 ввёл термин «протоплазма». В 1831 году английский ботаник Р. Броун впервые описал ядро растительной клетки, а в 1833 году установил, что ядро является обязательным органоидом клетки растения. С тех пор главным в организации клеток считается не мембрана, а содержимое.

 

 

  2. Клеточная теория

  Клеточная теория  — одно из общепризнанных биологических  обобщений, утверждающих единство  принципа строения и развития  мира растений, животных и остальных  живых организмов с клеточным  строением, в котором клетка рассматривается  в качестве единого структурного  элемента живых организмов.

  Клеточная теория  строения организмов была сформирована  в 1839 году немецкими зоологами  Т. Шванном и М. Шлейденом и включала в себя три положения. В 1858 году Рудольф Вирхов дополнил её ещё одним положением, однако в его идеях присутствовал ряд ошибок: так, он предполагал, что клетки слабо связаны друг с другом и существуют каждая «сама по себе». Лишь позднее удалось доказать целостность клеточной системы.

  В 1878 году русским  учёным И. Д. Чистяковым открыт  митоз в растительных клетках; в 1878 году В. Флемминг и П. И. Перемежко обнаруживают митоз у животных. В 1882 году В. Флемминг наблюдает мейоз у животных клеток, а в 1888 году Э. Страсбургер — у растительных.

Клеточная теория является одной из основополагающих идей современной биологии, она стала неопровержимым доказательством единства всего живого и фундаментом для развития таких дисциплин, как эмбриология, гистология и физиология. Основные положения клеточной теории не потеряли своей актуальности, однако со времени её создания были дополнены, и теперь она содержит такие утверждения:

  Клетка - элементарная  единица строения, функционирования, размножения и развития всех  живых организмов, вне клетки  нет жизни.

  Клетка - целостная система, содержащая большое количество  связанных друг с другом элементов  — органелл.

  Клетки различных  организмов похожи по строению  и основным свойствам и имеют  общее происхождение.

  Увеличение количества  клеток происходит путем их  деления, после репликации их  ДНК: клетка - от клетки.

  Многоклеточный организм  — это новая система, сложный  ансамбль из большого количества  клеток, объединенных и интегрированных  в системы тканей и органов, связанных между собой с помощью  химических факторов: гуморальных  и нервных.

  Клетки многоклеточных  организмов тотипотентны — любая клетка многоклеточного организма обладает одинаковым полным фондом генетического материала этого организма, всеми возможными потенциями для проявления этого материала, — но отличаются по уровню экспрессии (работы) отдельных генов, что приводит к их морфологическому и функциональному разнообразию — дифференцировк

  3. Методы исследования структуры клетки

  Впервые клетки удалось  увидеть только после создания  световых микроскопов, с того  времени и до сих пор микроскопия  остается одним из важнейших  методов исследования клеток. Световая (оптическая) микроскопия, несмотря  на своё сравнительно небольшое  разрешение, позволяла наблюдать  за живыми клетками. В ХХ веке  была изобретена электронная  микроскопия, давшая возможность  изучить ультраструктуру клеток.

  Для изучения функций  клеток и их частей используют  разнообразные биохимические методы  — как препаративные, например фракционирование методом дифференциального центрифугирования, так и аналитические. Для экспериментальных и практических целей используют методы клеточной инженерии. Все упомянутые методические подходы могут использоваться в сочетании с методами культуры клеток.

  Диаметр типичной  клетки животных составляет 10-20 мкм, что в пять раз меньше мельчайшей  видимой частицы. Только с появлением  совершенных световых микроскопов  в начале XIX века удалось установить  тот факт, что все ткани животных  и растений состоят из отдельных  клеток. Это открытие, обобщенное в форме клеточной теории Шлейденом и Шванном в 1838 году, знаменует собой начало клеточной биологии.

  Будучи чрезвычайно  малыми по размерам, животные  клетки к тому же бесцветны  и прозрачны: следовательно, открытие  их основных структур стало  возможным благодаря разработке  набора красителей в конце XIX столетия. Именно красители обеспечили  достаточный контраст для наблюдения  субклеточных структур. Сходная  ситуация наблюдалась в начале 40-х годов нашего столетия, когда  изобретение мощного электронного  микроскопа потребовало новых  методов сохранения и окраски  клеток. И только после того, как  они были разработаны, начала  проявляться вся сложность клеточной  структуры. В основе микроскопии  как методологии до сих пор  лежат способы приготовления  образца и возможности самого  микроскопа.

  Рассмотрим следующие  методы исследования структуры  клетки:

1) Световая микроскопия, которая подразделяется на следующие  виды: обычная оптическая, флуоресцентная, фазово-контрастная и интерференционная; 2) Электронная микроскопия; 3) Рентгеноскопия; 4) Фракционирование клеток.

  1.1. Обычная  оптическая микроскопия

  В общем случае  излучение данной длины волны  может быть использовано для  изучения только таких структур, минимальные размеры которых  еще сопоставимы с длиной волны  самого излучения. Этот принцип  ограничивает возможности любого  микроскопа. Предел разрешения светового  микроскопа задается длиной световой  волны, которая для видимого света  лежит в пределах от 0,4 мкм (фиолетовый) до 0,7 мкм (темно-красный). Из этого  следует, что самыми маленькими  объектами, которые еще можно  наблюдать в световой микроскоп, являются бактерии и митохондрии (их ширина ~ 0,5 мкм). Более мелкие  элементы клетки искажаются эффектами, вызванными волновой природой  света.

  Для приготовления постоянного препарата, который можно окрасить и наблюдать в микроскоп, клетки обрабатывают фиксирующим агентом с тем, чтобы иммобилизировать, убить и сохранить их. В современных методах, как правило, используется обработка альдегидами, например, формальдегидом или глутаральдегидом, которые формируют ковалентные связи со свободными аминогруппами белков и, таким образом, сшивают соседние молекулы.

  После фиксации ткани обычно режут на очень тонкие "ломтики" (срезы) на микротоме. Срезы толщиной от 1 до 10 мкм помещают на поверхность предметного стекла. В качестве заключающих сред используют парафин или специальную смолу. В жидком виде эти среды пропитывают и окружают фиксированную ткань: затем они затвердевают при охлаждении или за счет полимеризации, образуя твердый блок, который удобно резать на микротоме.

  Существует серьезная опасность того, что процедуры фиксации или заключения могут повредить структуру клеток или клеточных макромолекул. Вот почему предложен другой метод приготовления срезов - быстрое замораживание. Замороженную ткань режут на криостате в специальном микротоме, установленном в холодной камере.

  В содержимом большинства клеток, состоящих, как правило, на 70% из воды, практически отсутствуют компоненты, способные помешать прохождению световых лучей. Поэтому в естественном состоянии большинство клеток даже после фиксации и приготовления срезов практически невидимы в обычном световом микроскопе. Одна из возможностей их увидеть состоит в окраске клеток красителями.

  1.2. Флуоресцентная  микроскопия

  Поскольку большинство  макромолекул представлены в  клетках относительно незначительным  числом копий, одна или две  молекулы красителя, связанные с  макромолекулой, могут оставаться  незамеченными. Альтернативный подход  к проблеме чувствительности  состоит в использовании флуоресценции.

  Флуоресцирующие красители  поглощают свет одной длины  волны и излучают свет другой  длины волны, более длинной. Если  такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает  с длиной волны света, поглощаемого  красителем, и затем для анализа  использовать фильтр, пропускающий  свет с длиной волны, соответствующей  свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую  молекулу можно выявить по  свечению на темном поле. Высокая  интенсивность излучаемого света  является характерной особенностью  таких молекул.

  Применение флуоресцирующих  красителей для окраски клеток  предполагает использование специального  флуоресцентного микроскопа. Такой  микроскоп похож на обычный  световой микроскоп, но здесь  свет от осветителя, излучаемый  мощным источником, проходит через  два набора фильтров - один для  задержания света перед образцом  и другой для фильтрации света, полученного от образца.

  Флуоресцентная микроскопия  часто используется для выявления  специфических белков или других  молекул, которые становятся флуоресцирующими  после ковалентного связывания  с флуоресцирующими красителями. Например, флуоресцирующие красители  могут быть связаны с молекулами  антител, что сразу же превращает  их в высоко специфические  и удобные красящие реагенты, селективно связывающиеся со  специфическими макромолекулами  на поверхности живой либо  внутри фиксированной клетки. Для  этой цели обычно используют  два красителя - флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом.