Аффинноочищенная тонкослойная хроматография (тест - полоски на наркотики)

Введение

Тонкослойная  хроматография (ТСХ, TLC) - один из наиболее используемых методов хроматографического  анализа, но наименее популяризируемый. 

Несмотря на существовавшие до недавнего времени  существенные недостатки, она широко используется для качественного анализа смесей, в основном, за счет дешевизны и скорости получения результатов. Тонкослойная хроматография (ТСХ) первоначально была разработана для разделения липидов. Хотя хроматография на бумаге быстрее, чем хроматография на колонке, к недостаткам ее следует отнести то, что бумага может быть изготовлена только из материалов на основе целлюлозы, что не позволяет применять ее для разделения неполярных веществ.

Тонкослойная  хроматография сохраняет все  преимущества хроматографии на бумаге, но при этом позволяет использовать любой материал, который можно тонко измельчить и получить затем однородный слой. Это могут быть неорганические вещества, например силикагель, окись алюминия, диатомовая земля и силикат магния, а также органические вещества, в частности целлюлоза, полиамиды и порошок полиэтилена [1-5].

Цель курсовой работы рассмотреть применение метода тонкослойной хроматографии в медицине, на примере выявления наркотических веществ в биологических жидкостях при помощи тест-полосок.

Исходя, из целей  курсовой работы сформулированы и отработаны следующие задачи:

Рассмотрен  принцип действия аффинной хроматографии.

Рассмотрен  и проработан метод тестирования аффинных сорбентов.

Применение тонкослойной хроматографии в медицине на примере тест-полосок на наркотики

 

Глава 1. Теоретические основы проведения тонкослойная хроматография

 

1.1. Сущность метода аффинной хроматографии

Принцип действия состоит в том, что при погружении тест полоски в биологическую  жидкость (или другой жидкий образец), она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-полоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом.

Относительно  слабое обратимое взаимодействие между молекулами биполимеров и сорбентом может осуществляться за счет сил биологического сродства. Для осуществления фракционирования по биологическому сродству, т. е. методом аффинной хроматографии, один из «партнеров» такой пары химически закрепляют на матрице «биоаффинного» сорбента, а сорбцией и элюцией второго «партнера» управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в элюент солей, мочевины, детергентов, конкурирующих молекул или изменения его рН (рис.1).

 

Рисунок 1. Аффинная хроматография

В большинстве случаев  имеет место не хроматографический процесс фракционирования   смеси веществ, а очистка одного из них путем избирательной сорбции, промывки и последующей десорбции. Впрочем, возможны варианты и истинной хроматографии, использующей явление аффинного взаимодействия. При этом фракционированию подвергается смесь близко родственных биологических макромолекул, различающихся по своему сродству к одному тому же аффинному сорбенту.

Иногда явление биологического сродства используется только в процессе элюции. В этом случае вещество связывается с поверхностью твердого сорбента за счет ионного взаимодействия или сил адсорбции, а элюцию осуществляют путем увеличения его сродства к элюенту, куда вводят биологически родственные (в указанном выше смысле) молекулы. Такой процесс было бы точнее называть аффинной элюцией. Имеются примеры, когда один из партнеров аффинной пары имеет не биологическое происхождение, а представляет собой, например, сложный краситель, пространственная конфигурация которого имитирует какую-либо биологическую структуру [1-3].

 

1.2. Метод тестирования аффинных сорбентов

 

Аффинная хроматография основана на строго специфическом взаимодействии связанных с сорбентом антител с антигеном. Благодаря этому аффинная хроматография достаточно широко применяется в биотехнологии, т.к. позволяет достаточно легко извлекать минимальные количества целевого вещества из больших объемов, зачастую очень сложных растворов. Но такая специфичность имеет и свою обратную сторону. Так если в катионообменной хроматографии в 90% случаев используют SP или CM Sepharose, то практически для любого белка можно получить несколько аффинных сорбентов с разной емкостью, специфичностью и т.д. Что, совместно с очень большой стоимости аффинных сорбентов делает задачу их тестирования очень насущной.

Обычно, первой стадией получения аффинных сорбентов является стадия получения моноклональных антител при помощи гибридомной технологии.

Вторая стадия – активация матрицы (сшивка) полученными антителами при помощи химической реакции. Обе стадии имеют множество степеней свободы в результате на выходе обычно получается несколько сорбентов, свойства которых необходимо проверить. Понятно, что в целях экономии количество данных сорбентов будет очень мало, порядка нескольких миллилитров.

Важную роль в отделении и  очистке белковых и небелковых веществ  играют взаимодействия антигенов и  антител. Основанная на этих взаимодействиях  хроматография получила название иммунноаффинной. Новые горизонты открыло перед иммунноаффинной хроматографией использование моноклональных антител.

В аффинной хроматографии используют также групповые лиганды, связывающие, например, целую группу сходных по структуре ферментов. К таким  лигандам относятся кофакторы ферментов и их аналоги. В этом случае разделение и очистка индивидуальных веществ основана на их различном сродстве к лиганду, что позволяет собрать их порознь в виде отдельных фракций. Могут применяться и еще менее специфичные лиганды, связывающие целые классы веществ, например алкильные и арильные группы или лиганды, представляющие собой текстильные красители.

Аффинная хроматография  может обеспечить полную очистку  продукта из сложной многокомпонентной  смеси — культуральной [14-16].

 

Глава 2. Применение тонкослойной хроматографии в медицине

 

2.1. Характеристика тест-полосок

 

Современные иммунохимические методы анализа лекарственных  и наркотических средств обладают достаточно высокой чувствительностью, групповой специфичностью, простотой исполнения, позволяют анализировать одновременно большое количество проб без специальной подготовки и потому удобны для экспрессной скрининг-диагностики. Иммунохроматографический анализ (ИХА), который в литературе называют еще “стрип-тест”, QuikStrip dipstik, экспресс-тест, тест-полоски и т.п. является перспективным вариантом иммунного анализа.

Метод ИХА основан на протекании иммунной реакции антиген-антитело при движении тестируемого образца жидкости по полоске  и визуального детектирования образования окрашенных зон в различных участках полоски (тестовой и контрольной зонах).

В тест-зоне полоски иммобилизованы искусственные  антигены (подобные анализируемым веществам). Антитела к ним, связанные с красителем, нанесены на полоску у линии погружения ее в исследуемый образец биожидкости. При погружении тест-полоски в жидкость, последняя начинает мигрировать по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с жидкостью движутся антитела. Если в образце нет исследуемого токсичного вещества – антигена, то антитела доходят до вторичных (фиксированных) антигенов, связываются с ними, образуя окрашивание в тест-зоне. Если же исследуемый антиген присутствует в биожидкости, он связывает антитела у линии погружения в образец, и окрашивание в тест-зоне не наблюдается. Отсутствие или появление окрашивания в тест-зоне говорит о положительном или отрицательном результате анализа, соответственно. Образование окраски в контрольной зоне должно быть всегда и служит контролем сохранности тест полоски для использования, а также контролем правильности проведения анализа (рис.2). 

Рисунок 2. Результат тест-полоски на наркотики.

Результаты  реакции оцениваются визуально  в течение 5 -10 минут.

Пороговые уровни определения (Cut-Off) наркотических средств, психотропных веществ и психоактивных  лекарственных средств методом  ИХА.

Пороговые уровни определения (Cut-Off) –концентрация вещества, выше которой образец заведомо содержит определяемое вещество, ниже – делается заключение об отсутствии вещества в данном образце (таб.1).

Таблица 1. Пороговые уровни определения (Cut-Off)

Вещество / Группа веществ	Cut-Off, нг/мл
Опиаты	300
Каннабиноиды	50
Амфетамин	1000
Метамфетамин	1000
Экстази	500
Метадон	300
Кокаин	300
Фенциклидин	25
Бензодиазепины	300
Барбитураты	300

При том пороговые  уровни определения устанавливают, как правило, в концентрации в 3 раза большей, чем предел обнаружения  метода. Предел обнаружения (чувствительность метода) – минимальная концентрация вещества, которую с заданной доверительной вероятностью можно определить данным методом в данном образце. Так, например, в отношении группы опиатов чувствительность тест-полосок составляет 100 нг/мл. Поэтому даже разовое употребление кондитерских изделий с маком будет давать положительный результат анализа в образце мочи методом ИХА в течение 1 – 3 ч.

Перекрестная реактивность (кросс-реактивность)

Одной из проблем  определения токсикантов методом ИХА является перекрестная реактивность (кросс-реактивность) – то есть возможность обнаружения в результате анализа структурно родственных соединений (при наличии их в анализируемом объекте в определенных концентрациях) и как следствие из этого – получение ложноположительных результатов. Так например, наличие в моче метаболитов ранитидина дают положительный результат тестов на метамфетамин.

Поэтому ввиду вышеизложенного положительные пробы должны быть в дальнейшем подтверждены высокочувствительными и селективными методами [7-10,15].

 

2.2. Применение тест-полосок на наркотики

 

Мультитесты на наркотики представляют собой тесты на несколько видов наркотиков в отличие от монотестов, которые тестируют только на один конкретный вид наркотиков. Мультитесты лучше всего применять для первоначального тестирования, когда не знаешь, какой вид наркотика употреблял человек.

Мультитесты бывают нескольких видов, для выявления пяти, трех или  двух видов наркотиков одновременно, и состоят из 5-ти, 3-х или 2-х полосок на отдельные виды наркотика, соответственно (рис.3,4,5). Основным преимуществом таких тестов является удобство. Нет необходимости покупать отдельные монотесты на все группы наркотиков, можно воспользоваться мультитестом на самые распространенные виды.

Рисунок 3. Мультитест на 5 видов наркотиков

Тест-набор полосок предназначен для определения амфетамина, марихуаны, морфина, кокаина и метамфетамина в моче человека.

Рисунок 4. Мультитест на 3 вида наркотиков

Тест для  одновременного выявления Морфина, Марихуаны и Амфетамина в моче "ИммуноХром-3-МУЛЬТИ-Экспресс"

Рисунок 5. Мультитест на 2 вида наркотиков

Тест для  одновременного выявления Марихуаны и Морфина в моче "ИммуноХром-2-МУЛЬТИ-Экспресс"

Мультитесты на наркотики — эффективный, удобный и надежный инструмент для профилактики наркотической зависимости. Они помогут, рассеять подозрения или не упустить период «подсаживания на иглу» и своевременно начать лечение, что значительно увеличит шансы на успех. Тесты предоставляют возможность предотвратить развитие наркотической зависимости на ранних стадиях употребления наркотиков.

Если не удалось провести анализ в тот самый день, когда у предполагаемого наркомана были замечены признаки употребления наркотиков и отклонения в поведении. Наркотические вещества опийной группы остаются в организме около пяти дней, а анаша или марихуана — до двух недель. В течение этого времени вы можете провести проверку на наркотики.

Большинство мультитестов выявляют наличие наркотиков в биологических жидкостях человека (моча). Конечно, не всегда просто убедить человека, а особенно подростка, пройти тест на наркотики, а без его согласия, не представляется возможным получение необходимого для анализа образца мочи.

Есть специальные модификации тестов, которые можно использовать для выявления наркотиков вне организма человека. Тесты для выявления наркотиков вне организма человека используются оперативными службами уже давно, а теперь они доступны и обычным гражданам.