Библиотека ДНК

Библиотека ДНК — библиотека генов или библиотека клона Охватывает многочисленные последовательности, представляющие все разделы ДИК генома определенного организма. В общем виде — это случайная комбинация фрагментов ДНК генома определенного организма, связанная с вектором и клонированная в соответствующем хозяине.

В качестве векторов используются плазмиды, бактериофаги и вирусы. Затем композиция вектор + фрагменты ДНК (библиотека) вводится в клетку хозяина. В результате происходит клонирование. Транскрибированные фрагменты ДНК называются экзонами, а нетранскрибируемые — интронами. Экзоны и интроны являются основными элементами данной библиотеки.

Имеются библиотеки генов  цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, гамма интерферона, иммуноглобулинов) и других молекул иммунной системы. Создание библиотеки ДНК разной специфичности является важной задачей генной инженерии и молекулярной иммунологии.

Биостим — иммуномодулятор гликопротеидной природы, получаемый из клебсиелл. Стимулирует механизмы гуморального и клеточного иммунитета. Повышает содержание и функциональную активность лимфоцитов, фагоцитов. Применяется для иммунотерапии рецидивирующих инфекционно-воспалительных заболеваний бронхолегочной системы, злокачественных новообразований.

Методы клонирования ДНК

Геномные библиотеки, клонирование ДНК in vivo

После того, как ДНК сшита  в пробирке, ее необходимо размножить.

Существует два подхода  к клонированию ДНК. Первый подход предполагает использование бактериальных или  дрожжевых клеток для размножения  введенной в них чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой амплификацию ДНК in vitro.

Клонирование  ДНК in vivo

Используя микроорганизмы, можно  создавать два типа библиотек  ДНК: геномную и клоновую (кДНК).

Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома. 
Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком. 
Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).

Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается. 
Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.

Библиотека (банк) генов — это набор фрагментов ДНК, в котором представлены все (или определенная часть) генов организма. Библиотека генов представляет собой совокупность культур микроорганизмов (бактерий, дрожжей), в каждую клетку которых введен вектор, несущий один из фрагментов генома организма.

Библиотеку генов можно  длительно хранить (в замороженном состоянии) и, по необходимости, выделять отдельные микроорганизмы, содержащие фрагменты ДНК с нужными генами, и размножать (клонировать) их. Клонированные  таким способом гены выделяют из клеток и используют для решения различных  теоретических и практических задач генетики, медицины (в том числе диагностики наследственных болезней) и биотехнологии.

Секвенирование ДНК

А. Библиотеки генов

В генной инженерии часто требуется  выделить отдельный, пока еще не охарактеризованный фрагмент ДНК (DNA), например, с целью  определения его полной нуклеотидной последовательности. Такая задача решается путем создании библиотек кДНК. Библиотека ДНК состоит из большого количества векторных молекул ДНК,содержащих различные фрагменты чужеродной ДНК. Например, возможно получить все молекулы мРНК клетки в виде фрагментов ДНК - кДНК (англ. complementary DNA, cDNA) — и произвольно внедрить эти копии в векторные молекулы. Библиотека генов может быть получена путем расщепления ДНК клетки на небольшие фрагменты рестриктазами (см. с. 254) и последующего встраивания этих фрагментов в векторную ДНК. В качестве векторов для получения библиотек ДНК используются бактериофаги (сокращенно: фаги). Фаги — это вирусы, которые инфицируют бактерии, где их геном реплицируется вместе с бактериальным геномом (см. с. 390). Библиотеки генов удобны тем, что в них легко вести поиск необходимых в данный момент фрагментов. Работу начинают с того, что небольшую порцию ДНК, составляющую библиотеку (10⁵-10⁶ фагов), разбавляют, смешивая с клетками бактерии-хозяина, и помещают на питательную среду. Бактерии определенное время растут, образуя на питательной среде плотный мутный слой клеток. При этом бактерии, зараженные фагом, растут медленнее, чем неинфицированные клетки. Это приводит к образованию прозрачных кольцевых зон, «бляшек». Клетки в «бляшке» содержат потомство фагов из первоначальной библиотеки. Образовавшиеся колонии переносят на нитроцеллюлозные или найлоновые фильтры, накладывая их на поверхность слоя в чашке, и слегка подогревают. Если теперь инкубировать фильтр с меченым олигонуклеотидным зондом, соответствующим нуклеотидной последовательности целевого фрагмента, произойдет гибридизация зонда с гомологичной последовательностью ДНК. Место связывания зонда можно определить по радиоактивной или иной метке. После этого выделяют фаг из положительных (несущих метку) бляшек и размножают обычным образом. Большие количества необходимого фрагмента получают с помощью расщепления ДНК рестриктазами.

Б. Секвенирование ДНК

Современным методом определения  нуклеотидной последовательности ДНК  являетсяметод обрыва цепи (англ. chain termination method). Прежде всего фрагмент ДНК клонируют в фаге М13 (см. с. 390), из которого легко выделяют однонитевую ДНК (а). Ее гибридизуют с короткой ДНК, называемой праймером, которая связывается с 3'-концом однонитевой ДНК (б). Затем к полученной матрице добавляют четыредезоксирибонуклеозидтрифосфата дНТФ (dNTP): дАТФ (dATP), дГТФ (dGTP), дТТФ (dTTP) и дЦТФ (dCTP). Кроме дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в реакционную смесь добавляют один из четырех дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов [ддНТФ (ddNTP)] (см. схему). Затем с помощью ДНК-полимеразы ведут синтез второй (комплементарной) цепиДНК. Остановка синтеза (обрыв цепи) будет происходить всякий раз, когда вместо дНТФ в растущую цепь ДНК будет встраиваться соответствующий ему ддНТФ. На схеме принцип метода демонстрируется на примере с ддГТФ. В этом случае образуются фрагменты, которые включают праймер плюс 3, 6, 8, 13 или 14 других нуклеотидов. Для определения последовательности нуклеотидов необходимо поставить 4 отдельные реакции в присутствии каждого из четырех ддНТФ (в). Затем четыре пробы вносят в соседние лунки пластины геля и проводят гель-электрофорез (г) (см. с. 84). Длина пробега каждого компонента обратно пропорциональна длине цепи.

Как только фрагменты ДНК визуализированы (д), нуклеотидную последовательность можно прочесть прямо в геле снизу по направлению к старту в соответствие с очередностью, в которой фрагменты располагаются на отдельных «дорожках» (е). Реальная электрофореграмма с четырьмя дорожками приведена на рис. 2. При оптимальных условиях с помощью метода обрыва цепи можно в одном эксперименте определить строение фрагмента, включающего сотни нуклеотидов.