Бактериологический метод

Бактериологический  метод заключается в выделении  чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и  идентификации этого возбудителя  является основным методом бактериологического  исследования

Изучение свойств  микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация.

Чистая культура — это популяция микроорганизмов  одного вида. Для выде­ления чистой культуры аэробов используют методы, основанные на:

1. Механическим разобщением  бактериальных клеток;

2.  Действии физических  и химических факторов, оказывающих  избира­тельное действие;

3.  Способности некоторых  бактерий размножаться в организме.

Метод Дригальского основан на механическом разобщение на поверхности плотной питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуе­мого материала.

I этап.

1.  Определение микробного  состава исследуемого материала  (приготовле­ние мазка, окраска по Граму).

2.  Посев в чашку  Петри: одну каплю материала  наносят на поверхность МПА  и растирают шпателем. Не обжигая  шпателя и не набирая нового  мате­риала, засевают вторую и третью чашки.

3.  Засеянные чашки  переворачивают вверх дном и  инкубируют в термостате 18-20 часов  при температуре 37° С.

II этап.

1.  Микроскопическое  изучение колонки по величине, форме, окраске, ха­рактеру поверхности, краев, консистенции колонии.

2.  Микроскопическое  изучение одной исследуемой колонии  (приготовле­ние мазка, окраска по Граму).

3.  Оставшуюся часть  колонии пересевают в пробирку  со скошенным ога-ром.

4. Пробирку инкубируют  в термостате 18-20 часов при температуре  37° С. III этап.

Проверка культуры на чистоту (макроскопическим — однородный рост, микроскопическим- однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признакам клетки). Идентификация проводится по:

- ферментативным свойствам.

- антигенным свойствам  фагочувствительности токсигенности и другим признакам

1-й день: материал, поступивший на исследование, засевают на плотные накопительные питательные среды: Эндо, Левина, ВСА.

При посеве испражнений  небольшое количество материала  эмульгируют в физиологическом растворе. После оседания крупных частиц с поверхности жидкости берут 1—2 капли приготовленной взвеси, вносят ее в чашку Петри и на небольшом участке питательной среды растирают стерильным стеклянным шпателем. Затем шпатель отрывают от поверхности агара, и не прожигая его, распределяют остаток материала по остальной поверхности чашки.

Бактериологический  метод исследования (БЛМИ) – метод, основанный на выделении чистых культур  бактерий с помощью культивирования  на питательных средах и их идентификации  до вида на основании изучения морфологических, культуральных, биохимических, генетических, серологических, биологических, экологических характеристик микроорганизмов.

Цели БЛМИ:

1. Постановка этиологического  диагноза: выделение чистой культуры  микроорганизмов и её идентификация. 

2. Определение дополнительных  свойств, например, чувствительности  микроорганизма к антибиотикам  и бактериофагам.

3. Определение количества  микроорганизмов (важно в диагностике  инфекций, вызываемых УПМ).

4. Типирование микроорганизмов,  т. е. определение внутривидовых  различий на основании изучения  генетических и эпидемиологических (фаговаров и сероваров) маркёров. Это используется в эпидемиологических целях, т. к. позволяет установить общность микроорганизмов, выделяемых от разных больных и из разных объектов внешней среды, в различных стационарах, географических регионах.

I. Этапы БЛМИ при  выделении чистой культуры аэробов  и факультативных анаэробов.

1 этап.

А. Забор, транспортировка, хранение, предварительная обработка  материала. Иногда до посева проводят селективную обработку материала  с учетом свойств выделяемого  микроорганизма. Например, перед исследованием  мокроты или другого материала  на присутствие кислотустойчивых микобактерий туберкулеза, материал обрабатывают растворами кислот или щелочей.

Б. Посев в среду  обогащения (при необходимости). Его  проводят, если в исследуемом материале  содержится малое количество бактерий, например, при выделении гемокультуры. Для этого кровь, взятую на высоте лихорадки в большом объёме (8–10 мл у взрослых, 4–5 мл у детей) засевают в среду в соотношении 1:10 (для преодоления действия бактерицидных факторов крови); посев инкубируют при температуре 370С 18-24 ч.

В. Микроскопия исследуемого материала. Из исследуемого материала  готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микроскопируют. Оценивают присутствующую микрофлору, ее количество. В ходе дальнейших исследований должны быть выделены микроорганизмы, присутствовавшие в первичном мазке.

Г. Посев на питательные  среды с целью получения изолированных  колоний. Производят посев материала  петлёй или шпателем методом механического  разобщения на чашку с дифференциально-диагностической  или селективной средой с целью  получения изолированных колоний. После посева чашку перевора­чивают дном кверху (чтобы избежать размазывания колоний капельками конденсационной жидкости), подписывают и помещают в термостат при температуре 370С на 18-24 ч.

Следует помнить, что  при посевах и пересевах микробных  культур внимание работающего должно быть обращено на соблюдение правил асептики для предупреждения контаминации питательных  сред и предупреждения заражения  окружающих и самозаражения!

 

В случае инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, где имеет значение количество присутствующих микроорганизмов в патологическом материале, делают количественный посев  материала, для чего предварительного готовят ряд 100-кратных разведений материала (обычно 3 разведения) в стерильном изотоническом растворе хлорида  натрия в пробирках. После чего по 50 мкл каждого разведения высевают на питательные среды в чашках Петри.

 

2 этап.

А. Изучение морфотипов колоний на средах, их микроскопия. Просматривают чашки и отмечают оптимальную питательную среду, скорость роста, характер роста микроорганизмов. Для изучения выбирают изолированные колонии, расположенные по ходу штриха, ближе к центру. Если вырастает несколько типов колоний – каждый исследуется в отдельности. Оценивают признаки колоний (табл. 7). При необходимости чашки с посевами просматривают через лупу или с помощью микроскопа с объективом малого увеличения и суженной диафрагмой. Изучают тинкториальные свойства отличающихся морфотипов колоний, для этого из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму или другими методами, микроскопируют и определяют морфологию чистоту культуры. При необходимости ставят ориентировочную РА на стекле с поливалентными сыворотками.

Б. Накопление чистой культуры. Для накопления чистой культуры изолированные колонии всех морфотипов пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой и инкубируют в термостате при +370С (такая температура оптимальна для большинства микроорганизмов, но может быть и другой, например, для Campylobacterium spp. – +420C, Candida spp. и Yersinia pestis – +250C).

 

В качестве среды накопления для энтеробактерий обычно используют среду Клиглера.

 

^ Состав среды Клиглера: МПА, 0,1% глюкозы, 1% лактозы, реактив на сероводород (сернокислое железо + тиосульфат натрия + сульфит натрия), индикатор феноловый красный. Изначальный цвет среды малиново-красный, среда «скошена» в пробирках: имеет столбик (2/3) и скошенную поверхность (1/3).

 

Посев в среду Клиглера производится штрихом по поверхности и уколом в столбик.

3 этап.

А. Учет роста на среде  накопления, оценка чистоты культуры в мазке по Граму. Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нём в разных полях зрения обнару­живаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного плеоморфизма, присущего неко­торым видам бактерий, в мазках из чистой культуры могут встречаться одновременно клетки с различной морфологией.

Если в качестве среды  накопления использовали индикаторную среду Клиглера, то оценивают изменения ее цвета в столбике и скошенной части, по которым определяют биохимические свойства: ферментацию глюкозы, лактозы и продукцию сероводорода. При разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении глюкозы – желтеет столбик. При образовании CO2 в процессе разложения сахаров образуются газовые пузырьки или разрыв столбика. В случае продукции сероводорода отмечается почернение по ходу укола из-за превращении сульфата железа в сульфид железа. В анаэробных условиях в столбике щелочные продукты образуются в ничтожном количестве, поэтому здесь выявляется ферментация глюкозы.

Б. Окончательная идентификация  чистой культуры (определение систематического положения выделенного микроорганизма до уровня вида или варианта) и определение  спектра чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.